关键词： T细胞发育
赵红静 译
湖北荆州江汉石油学院生物系 （湖北荆州 434023）
T细胞库被可再生的干细胞持续不断地补充。在成体中，骨髓干细胞为胸腺提供前体细胞，并需要一系列通常由胸腺提供的人们尚未完全了解的信号来启动发育程序。由于未能在简单的体外培养中重复这个发育过程，所以阻碍了人们对全部独特信号特征了解的努力。在这一期《免疫学》中，Schmitt和Zuniga-Pflucker（注：该文可下载）描述了一个较为简单的体外培养系统，可将表达Notch配基delta-1的胎肝干细胞OP9细胞系发育为成熟的T细胞。该发现可大大促进T细胞发育的研究，并为在体外生成特定的T细胞群体提供一种方法。
淋巴细胞来源于已失去向红系细胞或髓系细胞分化能力的多能造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSC)的子代细胞。该分化途径中的第一步是生成能发育为T、B淋巴细胞的共同淋巴细胞前体(common lymphoid precursor, CLP)。为了获得完全发育成熟，B、T淋巴祖细胞必需能够通过在特定分化阶段调节抗原受体的表达的一个高度有序的过程进行有效的抗原受体基因重排(Rothenberg, 2000)。在成年小鼠中，B细胞的分化主要发生在骨髓中(BM)，而T细胞的分化绝大多数限制于胸腺。尽管B细胞的不同分化阶段已在体外获得成功，但是，迄今为止，T细胞在体外的生成仍需要麻烦的胚胎胸腺组织培养物，或者可简要代表胸腺三维结构的胸腺上皮细胞和基质细胞的重新堆积物。此表明胸腺结构和基质细胞提供正常胸腺生成所必需的独特信号(hare et al., 1999)。
发育中的T细胞随成熟不同而在胸腺中迁移到特定区域(图1)。在最近的研究中，Lind等(2001)提出：未特化的CLP在皮质-髓质交界区进入胸腺，在开始TCRβ重排时通过皮质向外迁移，并随β选择在囊下区增殖。CD4+CD8+(DP)胸腺细胞被认为是在皮质上皮细胞上经历阳性选择，然而成熟的CD4+或CD8+(SP)胸腺细胞则是在它们横穿进入髓质区的过程中经历阴性选择。发育中的胸腺细胞的这种动态迁移表明截然不同的信号存在于胸腺内的微环境中(Anderson 和Jenjinson, 2001)，但对这种空间限制性的信号是何物仍不完全清楚。最近的资料表明至少有某些这种信号是在Notch 信号途径发出的。
Schmitt和Zuniga-Pflucker在这篇报告中描述：在培养系统中如提供1个Notch信号可在体外使T细胞进入成熟的程序，否则促进B细胞发育。近来Jaleco对该数据进行了补充(2001)，他们检测了不同的Notch配基(Delta-1或Jagged-1)在调节人类造血祖细胞的分化中的作用。Jaleco等通过有趣的数据显示不同的Notch配基可能在T细胞系发育中起其独特的效应，但它们不能使任何T细胞成熟。这些报告共同强化了一个观点，这就是Notch信号在T细胞发育中调节关键的步骤，并可能提供一般由完整的胸腺所提供有空间限制性信号。虽然Schmitt和Zuniga-Pflucker提出的资料决没有对T细胞的发育做出定论，但是他们描述了以前无法获得的，操作简便的培养系统，毫无疑问将会推动未来对复杂的分化途径中所需的特征性信号的研究。
Notch方法总结
Notch途径是通过调节受体细胞和含配基细胞的胞间接触来调节包括蠕虫、蝇类、哺乳动物在内的多种生物发育的一种进化保守信号机制。Notch信号被认为是影响复杂器官系统发育的模式，并可在进行性的发育阶段被程序激活(Artavanis-Tsakonas等，1999)。已鉴定出4种哺乳动物Notch受体，其与或属于Delta-1或属于Jagged/Serrate家族的至少有5种不同的配基家族相连接(图2)。Notch受体是I型具有共享一独特信号机制的跨膜蛋白。与配基相连后，在Notch胞内区诱导出蛋白水解缝，以产生活化的受体形式(Notch IC)转移入核，与随处可遇的转录抑制子CBF1/RBP-Jκ(CBF1)相互作用，激活转录。Notch IC中的高度保守的RAM和锚蛋白域通过直接与CBF1相接而置换出转录抑制子，同时一特定的转录激活域(TAD)募集转录辅激活蛋白(Mumm and Kopan, 2000)。
Notch 信号调节T细胞发育
有相当多的证据表明通过Notch受体发出的信号调节T细胞发育的多个阶段。一个清晰的共识正在逐步达成：Notch 1提供促进CLPs分化成为T细胞系，并抑制B细胞分化的直接信号来调节T细胞发育的最早期阶段(Izon et al., 2002; Radke et al., 2002). 胸腺中造血干细胞缺乏Notch1功能将阻断T细胞分化并导致未熟B细胞积累。相反，骨髓中造血干细胞过量表达Notch-Ic而获得Notch1功能将阻断B细胞的发育并导致T细胞系提交。Notch途径可能也在维持造血干细胞种群、调节胸腺细胞发育成为γδ系而非αβ系、促进或抑制未熟的CD4+ 或CD8+ 胸腺细胞的成熟等方面起作用。
对Notch如何信号影响如此多种功能的研究以达成共识的努力因为系统固有的冗余而加重。4种哺乳动物Notch受体及配基在淋巴器官中以一种与它们的功能并无直接联系的复杂的重叠方式表达。例如，通过Notch1发出的信号影响胸腺中T系细胞的提交，但是也有证据表明Notch1也表达于造血干细胞、胸腺细胞以及成熟的B细胞上(Anderson and Jenkinson, 2001; Bertrand et al., 2000). 此明显的矛盾可用观察资料解释：Notch信号通过影响与配基连接或调整胞内信号的大量分子而主要起调节作用。Notch受体对Delta或Jagged/Serrate家族中的配基响应的能力受到具3个不同分子的Fringe家族影响(Lunatic, Maniac, and Radical Fringe)。 有趣的是：胸腺细胞上过量表达Lunatic Fringe似乎抑制Notch信号，导致胸腺中B细胞的分化增加(Koch et al., 2001)。在胞内区，Notch信号可被包括Numb、Hairless、Deltex在内的大量胞质或核蛋白调节。这些分子可调节Notch信号的强度、持续时间和性质(Radke et al., 2002).
最后，有证据表明Notch信号可被其他信号途径的活性所修正。比如，通过Notch1和Notch2发出的信号可被M-CSF或GM-CSF的刺激产生不同的影响(Milner and Bigas, 1999). 这些观测资料都表明Notch信号对特异发育阶段或处不同微环境的细胞的影响是不同的。所有这些因子可能同时对单个细胞起作用，因而需要一个简单的可分别检测Notch信号系统的单个组分的体外实验系统。
T细胞发育的新体外培养系统
Schmitt和Zuniga-Pflucker提出T细胞和B细胞分化的所需条件非常相似。通过在基质细胞上表达Notch配基Delta-1, OP9-DL1在IL-7和Flt3-L的影响下能够介导鼠科胎肝干细胞(sorted CD117-/Sca1hi/Lin-)分化为功能性成熟的CD8+细胞。含未修饰的OP9基质细胞的相似的培养中在培养的早期阶段产生NK细胞，然后专门产生B细胞。
在OP9-DL1系统中，干细胞被诱导程序性分化和胸腺里发生的相似。在12天内，细胞数量扩增2000倍，产生大量γδ和αβ胚系T细胞。αβT细胞似乎启动1个完全的发育程序，包括CD4和CD8分子表达的正常进程。到第7天，可见CD4-CD8-(DN)亚群，可由表达CD44、CD25和TCRβ重排决定。作者报道了接种了RAG-/-干细胞的培养物经历了预期的发育，在DN3阶段停止。上述培养系统将大力促进将来的研究，检测在发育过程和DN阶段之间对细胞因子或细胞表面受体的特定需要。按照Wolfer et al. (2002)的资料，该分析尤其有趣，表明通过Notch1发出的信号是完整的TCRβ重排和通过至少DN2/DN3阶段的正常胸腺细胞进程所必需的。
Schmitt and Zuniga-Pflucker也提出一些资料表明正常的、有功能的成熟T细胞能从它们的OP9-DL1培养物中产生。作者可以培养出少量的表达成熟的表面TCR的CD8+T细胞。因为在体外用plate-bound 抗-CD3刺激能诱导合成IFNγ，所以这些TCRhiCD8+T细胞中至少有一些似乎已功能成熟。与正常CD8+T细胞相比，这种激活如何作为控制因素并没显示出来。另外，作者也没有通过在培养物中提供MHC-II来试图产生成熟的CD4+T细胞。
并不清楚是否在OP9基质细胞上表达Delta-1就足够诱导完整的正常T细胞发育程序，包括功能性成熟的CD4+和CD8+T细胞的阳性和阴性选择。尽管如此，上述资料清晰描述了正常的T细胞特异性的发育程序至少可有效地开始和进行到CD4+CD8+DP阶段。Schmitt and Zuniga-Pflucker预测在OP9-DL1共培养物中T细胞在干细胞中的祖细胞几率大约为1/17，在OP9共培养物中B细胞为1/6。T祖细胞的这种高几率表明所观测到的T细胞群是由未授权的干细胞库分化而来，而不是少量污染的未熟T细胞的选择性生长。
对调节T细胞成熟的信号定义
Schmitt and Zuniga-Pflucker所提供的上述资料与Jaleco et al.报道的以前的研究相似，表明Delta-1而不是Jagged-1能抑制B 细胞提交。Jaleco et al.使用了1个相似的利用不同基质细胞系(S17)和从人类索状组织血液中分离出来的干细胞(CD34+)的培养系统。这2个研究均报道了含用Delta-1转染的基质细胞的培养物中B细胞发育受到抑制。Jaleco et al. 生产出大量的(达66%)似乎是未熟的T/NK祖细胞，表达CD7和胞内CD3和少量的(达4%)CD4+CD8T+ 细胞。 Jaleco et al. 的惊人发现是在胸腺上皮细胞均能表达2种不同的Notch配基：Jagged-1和Delta-1，但他们的表达量并不一样。只有Delta-1能够抑制B系细胞提交并且促进未熟的T细胞前体分化。但是，对这2种研究的比较又引起另外的重要的问题。例如，确定为什么Jaleco 等不能培养出明显数量的DP T细胞的原因是重要的。无效的T细胞成熟可能是由于人类和鼠干细胞种群之间、添加的生长因子或基质细胞提供的独特的阳性和阴性调节信号的差异所造成的。Schmitt和Zuniga-Pflucker 试图通过直接在他们的培养系统中比较OP9和S17基质细胞来确定该问题。尽管未修饰的OP9和S17基质细胞在产生大量的B细胞方面看起来功能相同，但是，OP9-DL1基质细胞与S17-DL1相比，其产生DP T细胞的能力非常优良。首次清楚的是在T细胞分化的哪阶段两基质细胞间存在着差异。不能产生有意义数量的DP T细胞可能得归因于T/NK结果的转换或早期T祖细胞的无效成熟。无论如何，从该结果可得出重要的一点：T细胞的产生所需要条件比仅仅是Notch信号的存在与否要多。
Notch信号在T细胞发育中起作用的意义
从上述资料引起一些关于Notch信号在不同的T细胞发育阶段所起作用的重要问题。例如，与接触性胸腺结构相关的Notch受体和配基如何在胸腺内生成过程中在胸腺内空间表达？也许是全部的胸腺产出细胞或相对数量的不同的T细胞亚系可能由胸腺内不同的Notch配基的可得性所决定。未提交的干细胞或发育中的T细胞可能会竞争与Notch配基的连接，或者差异性地诱导调节Notch 信号的分子表达。
随着胸腺细胞迁移进入胸腺内的特定区域，Notch配基的空间组成也可能通过调节Notch信号的持续时期来调节胸腺细胞的成熟。并不清楚在Schmitt和Zuniga-Pflucker所报道的系统中，发育中的T细胞在培养期能否接近Delta-1。有证据表明Notch信号在正常胸腺细胞发育过程中被改变了(Deftos et al., 2000)，而与此相冲突的报告则争辩说在DP阶段过量的Notch信号可能在DP阶段外抑制可促进成熟(Izon et al., 2002)。Schmitt和Zuniga-Pflucker所描述的培养系统将使得将来在不同胸腺细胞发育阶段通过添加或清除不同的Notch配基来精确定位这些问题。
治疗意义
过继性的T细胞免疫疗法(Adoptive T cell immunotherapy)是应用在以抗肿瘤为目的的一外专业术语，方法为重新输入从病人体内分离出来的并在体外以抗原加上IL-2扩增的特异性的CD8+T细胞(Greenberg and Riddle, 1999)。Schmitt和Zuniga-Pflucker所描述的干细胞产生T细胞的培养系统能不能用来产生预期的抗肿瘤特异性的T细胞或者是为免疫缺陷病人生产各种T细胞种群？某些T细胞缺陷病人如Di George综合症是因为胸腺基质细胞发育缺陷，而且有正常造血干细胞的病人可从上皮胸腺移植中受益。将转染了Delta-1的基质细胞与外周血干细胞共培养能产生移植用的T细胞库吗？为达到最好的免疫保护，基质细胞必需与患者的HLA相配以便合适的HLA等位基因的阳性选择选择出最有用的T细胞组分来保护宿主，诱导完全的免疫耐受以防止自身反应性和自身免疫疾病。我们并不知道CD4和CD8阳性选择是否确实在这些"简单"的培养物中产生，也不知道是否对完整的阴性选择有影响。多半胸腺结构是为清除危险的抗-自身-反应性的克隆，为控制免疫应答的调节T细胞的发育的促进而特异设计的。在我们对此了解更多以前，使用体外系统来重建T细胞区似乎是危险的疗法。
此种新系统能否用于目标更确切的方法以产生具有所希望的抗肿瘤特异性的新的效应T细胞?为回答这个问题，我们需要(1)肿瘤靶表位方面的知识，比如说HLA-A2/melanA，(2)含Delta-1的基质细胞系，可携带A2基因和MHC I提呈缺陷，如TAP缺陷的结果，以及(3)与靶表位相关的改变了的肽配基，与HLA-A2接合，为与肿瘤抗原有高亲和力的CD8+ T细胞的阳性选择服务。患者的干细胞与加入肽段的这样的基质细胞共培养将导致CD8+T对A2/肽复合物的选择性成熟(因为在基质细胞上只提呈这些配基)。成熟的CD8+T细胞可在肿瘤抗原外加IL-2上扩增以便重新注入患者体内。这种方法可能比产生多种T细胞库危险性小，并可避开肿瘤患者可能没有或仅有低亲和力的T细胞的问题。但是，我们并不清楚T细胞总组成在这些培养物中是否符合选择规律。
使用表达Notch配基的基质细胞系的这种新方法可以使培养物中的T细胞提交和发育，为分化程序中详细的实验分析立即提供极好的细胞库。临床应用在期待中。（注：插图见原文）
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