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作者：小又
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如果要评2017年RNA领域最火热的研究，m6A修饰一定榜上有名！这不，2017年还未过完，RNA m6A的研究就已多次登上nature, cell, cancer cell等许多著名杂志，涉及领域从RNA翻译效率到DNA损伤修复，从生长发育到肿瘤形成，m6A的影响力可见一斑。
然而，m6A的研究才刚刚开始，还有很多空白，还有很多值得探索的问题。小伙伴们是不是摩拳擦掌，跃跃欲试却又不知关于RNA m6A的研究该从哪下手呢？不用担心，跟着小又，只需三步，带你玩转RNA m6A修饰研究！
一图看懂RNA修饰
磨刀不误砍柴工，步入正题前，一幅图让大家了解什么是RNA m6A修饰。
如上图，m6A是mRNA上最丰富的甲基化修饰，指碱基A第6位N原子上的甲基，主要存在于mRNA的CDS区和3‘UTR区，影响mRNA的稳定性，翻译效率，可变剪接和定位等。此外，长非编码RNA以及microRNA等非编码RNA也存在m6A位点。
RNA甲基化分子机制
RNA甲基化过程需要三类分子参与：Writers, Erasers和Readers。
Writers：在RNA加上甲基，介导RNA的甲基化修饰过程。干这活的是甲基转移酶，最常见的分子是METTL3和METTL14，两者可在体外和体内催化mRNA（和其他细胞核RNA）的m6A甲基化。WTAP是这种甲基转移酶复合体中的另一个关键组分。
Erasers：将RNA上甲基去除，介导RNA的去甲基化修饰过程。FTO和ALKBH5可以去除mRNA（和其他细胞核RNA）上的m6A甲基化。
Readers：识别RNA甲基化修饰的信息，并参与下游RNA的翻译、降解等过程。比如，YTHDC1可与mRNA上的m6A修饰，促进mRNA出核运输与可变剪接。YTHDF1/YTHDF3识别m6A后可促进mRNA的翻译，而YTHDF2与m6A的结合则会促进mRNA的降解。
RNA甲基化研究实例
接下来，以一篇今年初发表在cancer cell上的文章为例，带大家解析m6A研究的三步套路。
由上文的m6A简介可以看出，m6A由相应的蛋白酶完成，那么，要研究m6A在某一体系中的作用，也要从m6A相关蛋白酶下手。研究者通过整理之前的RNA芯片数据，发现FTO(m6A去甲基化酶)在特定的急性髓系白血病中高表达，并且通过质谱检测发现，在含MLL-AF9融合蛋白的白血病中，m6A的整体水平比对照组低。
那么，FTO在特定白血病亚型中的高表达，是否是其发挥了癌基因的功能呢？通过构建稳定敲低FTO的细胞系，研究者在细胞实验和动物实验中证明，敲低FTO可以显著抑制肿瘤细胞的增殖以及延长实验小鼠的生存时间。
接下来，就是文章的重点和难点——FTO发挥癌基因作用的具体机制是什么？关于机制的探索，这不仅是m6A研究的重点，相信也是每个课题都要面对的问题。幸运的是，FTO做为m6A的去甲基化酶，功能是相对确定的，要寻找FTO的具体作用机制，实际上是寻找FTO靶向的mRNA。
这里不得不提到的是m6A-seq技术，该技术通过用m6A特异的抗体将含m6A修饰的mRNA从总mRNA中富集出来，再结合高通量测序技术，就可以知道哪些mRNA含有m6A修饰。
研究者通过对过表达FTO和正常样品的m6A-seq测序，发现了一批在过表达FTO后m6A修饰减少的基因，然后结合普通RNA测序，发现这些m6A减少的mRNA在表达量上也发生了变化。
研究者从变化倍数以及基因本身的功能着手，最终锁定了两个基因：ASB2和RARA并认为它们是FTO最主要的靶标，并在western blot实验以及双荧光素酶实验中得到了验证。End。
文章解析到这，相信大家也已经看出了m6A研究的三步套路：
1.寻找m6A相关酶在某一体系（疾病）中的异常表达情况。鉴于mRNA的测序和芯片数据较全，建议大家从数据库中寻找，比如cbioportal,oncomime和GEO datasets等。
2.细胞及动物的表型实验。通过敲低和过表达该m6A修饰酶，检测细胞的变化，包括细胞增殖，凋亡，衰老等指标。
3.通过m6A-seq和RNA-seq的结合，寻找m6A含量变化和RNA分子数量变化最大的mRNA。这部分工作对生物信息学的要求较高，好在已有部分测序公司可以提供相关的分析。
以上，大家是否感觉cancer cell的文章也不是很难呢？这篇文章的亮点在于第一次在肿瘤中系统地研究了m6A去甲基化酶FTO的功能，并建立了较完善的研究方法，对后人的研究启发很大，也是一篇里程碑式的文章！
Q&A
现在，肿瘤中m6A的功能研究还有很多空白之处，小伙伴们看准了就赶紧下手吧！想到大家在研究中可能遇到的问题，小又在此先自问自答了。
1 我研究的领域是XX癌，但是翻遍了各大数据库，都没发现METTL3/FTO和ALKBH5等m6A相关酶有差异表达，怎么办？m6A是不是跟我无缘了？
回答：要想和这样一个重要的RNA修饰擦肩而过，还真是挺难的。M6A甲基化酶在某一体系中即使没有异常表达，也不能说它们没有功能。
推荐这篇PNAS的文章，研究者通过阅读m6A文献，发现NANOG的mRNA有m6A修饰，而NANOG在乳腺癌中是一个非常重要的癌基因，猜测m6A是否会在NANOG介导的乳腺癌中发挥功能，并在通过实验验证了这一点。
2 除了m6A-seq外是不是还有其他RNA甲基化的检测方法？
回答：对RNA甲基化的研究才刚起步，因此现在RNA甲基化的检测方法并不多，大致有3种，除了m6A-seq之外还有miCLIP和SCARLET。
miCLIP是将含有m6A的RNA与相应抗体结合以后，通过紫外进行交联，反转录得到的cDNA会出现突变或者截断，这样就可以指示m6A的存在。该方法的分辨率为单核苷酸水平。
SCARLET则是通过结合位点特异性的RNA酶H、放射标记和TLC（薄层层析）的方法，对RNA甲基化修饰进行检测，该方法是从单基因通量下检测RNA的甲基化修饰。3 套路太简单了，想要做得更深，更有新意，该怎么办？
回答：欣赏你这样的有志少年！推荐也是今年发表在cancer cell上的文章，研究者发现m6A去甲基化酶ALKBH5通过影响FOXM1的功能，在恶性胶质瘤中扮演癌基因的角色，并创造性的将近年来火热的长非编码RNA纳入该研究，发现ALKBH5对FOXM1的选择性去甲基作用是通过长非编码RNA FOXM1-AS介导的。
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