ctDNA用于肿瘤早期筛查，快来看看这篇PNAS是怎么做的！

液体活检是癌症检测的一种新兴的手段，它一般是指通过检测血液中的CTC（循环肿瘤细胞，CirculatingTumor Cell）和ctDNA（循环肿瘤DNA，Circulating Tumor DNA）获取患者肿瘤病变信息，用以帮助诊断和治疗。

从基金项目来看，去年中标的项目中通过CTC或者ctDNA进行诊断的有：

1. 基于链式杂交反应以及新型纳米材料的信号放大策略在痕量外周血循环肿瘤DNA检测中的应用研究

2. 基于DNA纳米技术的循环肿瘤细胞检测新方法及其响应机制研究

3. 基于体积排除微流控细胞分离芯片的乳腺癌循环肿瘤细胞分型研究

4. 靶向DLL3多功能纳米球高效精准检测小细胞肺癌循环肿瘤细胞的研究

5. 重楼皂苷诱导循环肿瘤细胞失巢凋亡抑制肺癌转移的作用及机制研究

6. 高发区基于EB病毒抗体联合循环肿瘤细胞筛查早期鼻咽癌体系的建立以及流行病学研究

7. 基于磁小体链和可调磁场微流控芯片技术提高检测痕量循环肿瘤细胞效率的研究

8. 基于线粒体靶向AIE探针的循环肿瘤细胞检测新技术及其机制研究

9. 基于循环肿瘤DNA的早期肺癌淋巴结转移相关甲基化标志物的鉴定及无创预测工具的构建

10. 循环肿瘤微癌栓形成及其在肝癌转移复发中作用的机制研究

11. 循环肿瘤DNA突变和甲基化检测在胃癌筛查和预后评估中的作用

12. 基于高效捕捉CTC及DNA胞嘧啶修饰建立术前肝癌微血管侵犯的临床预测模型及效果评价的研究

13. 基于CRISPR/dCas9技术的肝癌ctDNA预后相关甲基化标志物的功能机制研究

14. 基于多模态功能影像组学及ctDNA预测食管癌新辅助放化疗疗效的研究

目前就有一篇很好的关于应用对患者血液中ctDNA的检测进行胰腺癌的早期筛查。

题目：Combined circulatingtumor DNA and protein biomarker-based liquid biopsy for the earlier detectionof pancreatic cancers（PNAS | September 19, 2017  ）

下载链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5617273/ 

意义：

很少有胰腺癌患者存活时间超过5年，部分原因是大多数患者只有在疾病进展到晚期的时候才能确诊。在这项研究中，作者展示了如何将循环肿瘤DNA（ctDNA）中的突变与蛋白质标记物结合起来，可以在保持特异性的同时，提高灵敏度。ctDNA和蛋白质标记物的组合优于任何单一标志物。此外，该组合检测到近三分之二的胰腺癌。该方法也可以应用到许多其他癌症的早期检测中。

这种方法的基本概念，通常被称为“液体活组织检查”，是因为癌细胞，如正常的自我更新细胞一样经常更新。液体活组织检查概念的基础是在循环中鉴定的突变DNA模板来源于癌症。从肿瘤中垂死细胞释放的DNA可以逃逸到体液如血浆中。大多数关于循环肿瘤DNA（ctDNA）的研究都集中在跟踪癌症患者，而不是评估其在筛查中的应用。已经有大量研究表明，具有早期癌症的患者中相当小的一部分在其血浆中具有可检测水平的ctDNA。在当前的研究中，作者确定了ctDNA和蛋白质生物标志物是否可以结合起来，以保持检测特异性的条件下提高检测可切除胰腺癌的敏感性。

癌症的早期诊断是减小癌症死亡的关键之一，因此作者致力于开发一种无创血液检测用于胰腺癌的早期筛查，作者将KRAS基因突变的血液检测与严格阈值的蛋白质生物标记物结合起来，以确定这些标记物的组合是否优于任何单一的标记物。此研究所测试的队列包括221名患有可切除的胰腺导管腺癌的患者和182名没有已知癌症的对照患者。在66名患者（30％）的血浆中检测到KRAS突变，并且在血浆中发现的每个突变与随后在患者的原发肿瘤中发现的相同（100％一致）。作者将KRAS与四种阈值蛋白质生物标志物结合使用可将灵敏度提高至64％。来自对照组的182个血浆样品中只有一个对任何DNA或蛋白质生物标记物呈阳性（99.5％特异性）。

主要内容：

简而言之，（1）作者首先使用QIAsymphony循环DNA试剂盒从血浆中纯化DNA，（2）然后使用含有独特标识符（UID）和扩增子特异性序列的定制引物来扩增血浆DNA，（3）并将得到的产物在Illumina MiSeq或HiSeq仪器上对所得产物进行测序，（4）接下来使用Bio-Plex 200平台（Bio-Rad）上的基于Luminex珠的免疫测定法测定蛋白质生物标志物血浆浓度。如果样品含有KRAS突变或CA19-9，CEA，HGF或OPN的浓度大于100 U / mL，7.5 ng / mL，0.92 ng / mL或158 ng /，则血浆样本评分为阳性。本研究中应用的所有样本均经批准后获得，并获得知情同意。

1、胰腺癌以及健康对照样本的临床病理学统计

作者对221名胰腺癌患者的临床病理学进行了统计，然后对胰腺癌进行分期，分为IA，IB，IIA，IIB期，将IA，IB期分为一组，IIA，IIB期分为一组，应用Kaplan-Meier方法对两组患者的总体生存状态进行了评估，结果显示，IA和IB期患者的总体生存状态明显好于IIA和IIB期患者。

2. 基于PCR的检测方法来识别中血浆中特异的KRAS突变

作者设计了一种基于PCR的检测方法评估了在胰腺癌中KRAS基因经常发生突变的两个片段，然后应用“Safe-sequencing System”的技术来检测KRAS突变，应用这种技术在221名胰腺癌患者中检测到了66名患者具有KRAS突变。并在这66名患者中的50名患者的原发肿瘤中检测到了KRAS突变，并且在患者血浆中检测到的突变与患者原发肿瘤中突变是一致的。

3. 同时评估血浆中CA19-9和KRAS突变

为了探究是否KRAS ctDNA与CA19-9的结合对比于单独的KRAS ctDNA检测可以提高检测的灵敏度，作者根据先前的研究对CA19-9设定了一个100U/ml的阈值，在221名胰腺癌患者中检测到了104名患者具有CA19-9这种蛋白质生物标志物水平的升高。为了探究CA19-9以及ctDNA是否是独立的检测指标，作者对每种检测方法检测的胰腺癌患者的数目绘制了韦恩图，发现CA19-9以及ctDNA检测到的患者只有一小部分重叠（42），说明加入CA19-9可以提高ctDNA检测的灵敏度。

4. 加入其它蛋白质生物标志物来提高灵敏度

受以上结果的鼓励，作者试图在CA19-9以及ctDNA检测的基础之上加入其它的蛋白质生物标志物进一步提高检测的灵敏度，因此作者评估了在癌症中经常使用的生物标志物，最后发现其中有5个即CEA，HGF，中期因子（Midkine），OPN和催乳素是最有前景的。

随后，作者发现，中期因子和催乳素这两种蛋白质生物标志物受血浆采集位点的影响。因此，作者在麻醉给药前后观察了几种蛋白质生物标志物的水平，发现只有中期因子和催乳素在麻醉给药前后的浓度变化较大，因此将它们排除在进一步的分析中。

接下来，作者为这三种蛋白质生物标志物设定了阈值，每种生物标志物的阈值要比在273名独立的正常血浆样本中观测到的蛋白质的水平高出10%，最终由HGF，CEA，OPN分别检测到了23，14，15名胰腺癌患者，说明这三种蛋白质生物标志物每种单独检测的性能都不是很好。

为了评估在联合检测时每种生物标志物的性能，作者对联合检测时每种蛋白质生物标志物的性能进行评估，并绘制了ROC曲线，结果表明联合检测时每种标志物的性能都要优于单独检测的性能。

5. 生存分析对临床病理学因素与患者预后状态进行评估

作者根据几种胰腺癌患者的临床病理学对患者的预后状态进行了评估

6. 在组合测定中加入TP53

众所周知，TP53也是癌症中经常发生突变的基因，作者为了探究加入TP53是否可以提高ctDNA检测的灵敏度，因此评估了152名肿瘤以及血浆都可获得的癌症样本，在64名患者的肿瘤中发现了TP53突变，并在这64名患者中的13名患者血浆中发现了TP53突变，结果有两点值得我们注意。

（1）在13名具有TP53突变的患者中有12名患者也包含KRAS突变，因此TP53突变检测不会显著提高KRAS ctDNA检测的灵敏度。

（2）TP53与KRAS的MAF具有很强的相关性。这提供了ctDNA测定的可靠性及其定量性质的另一种验证。

Ref：Combined circulatingtumor DNA and protein biomarker-based liquid biopsy for the earlier detectionof pancreatic cancers.Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Sep 19;114(38):10202-10207.