摘 要：目的 制备中华眼镜蛇神经毒素（NT）可溶性微针（DMNs-NT），并考察其理化性质及体外透皮性能。方法 采用两步离心法制备DMNs-NT，并以微针针体的成形性、机械强度及背衬层的柔韧性为指标，考察硫酸软骨素（CS）与聚乙烯吡咯烷酮（PVP k30）的比例、基质液含水量、背衬层材料；HPLC法测定其载药量，正置光学显微镜表征，并考察稳定性；采用Franz扩散池考察其体外透皮性能。结果 通过单因素考察确定DMNs-NT制备的最佳处方工艺为CS与PVP K30比例1∶1、基质材料与加水量比例5∶4、以羧甲基纤维素（CMC）为背衬层材料。DMNs-NT针体呈四棱锥形，表面平整，长度约为500 μm，每片含药量为（15.4±0.5）μg，药物位于针体上部，3个月内稳定性良好。离体皮肤渗透结果显示，4 h后DMNs-NT中NT的累积渗透量可达95.8%，而NT溶液几乎没有透过皮肤，证明可溶性微针对NT透皮递送具有良好的促进作用，能有效穿透大鼠离体皮肤。结论 制备DMNs-NT机械强度及柔韧性好，实现了大分子药物NT的透皮递送。
中华眼镜蛇Naja atra毒液中的一种多肽成分神经毒素（neurotoxin，NT），具有镇痛、抗炎、抗衰老及免疫抑制作用[1-2]。目前，已有肌内注射剂科博肽注射液上市，用于治疗三叉神经痛、晚期癌痛、关节痛等。但注射给药引起患者疼痛与反感，由于注射所致体内分布过快，有呼吸抑制的副作用。
经皮给药系统（transdermal drug delivery system，TDDS）已经被广泛应用于药物递送，使用便捷，血浆药物浓度稳定，能减少不良反应，提高依从性[3-6]。皮肤角质层（stratum corneum，SC）阻止了水溶性药物和高分子亲脂性药物的透皮效果。目前，渗透促进剂、离子导入、电穿孔和超声来增加药物经皮吸收量[7-8]，对于神经毒素等多肽类及大分子药物的透皮依然是个难点。近年来，越来越多的研究表明微针技术可用于多肽类及大分子药物经皮给药，其作用机制为在皮肤SC上形成微米级的通道使药物顺利通过，且刺入深度达不到真皮层，是一种无痛的给药方式[9-13]。微针一般分为固体微针、涂层微针、中空微针和可溶性微针（dissolving microneedles，DMNs）这4种，可由多种材料制成，包括金属、无机硅、玻璃、聚合物等[14-15]。其中，由可降解的水溶性聚合物制成的可溶性微针用于经皮递送蛋白类药物，引起极大关注。通常，DMNs作用于皮肤后，构成针体部分的生物相容性聚合物可溶解于少量组织液中，包封的蛋白类药物即可释放[16-18]。因此，DMNs是大分子药物理想的经皮递送方式，其不仅有其他微针的优点，而且针体部分的完全溶解不会引起人体危害[19]。聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、羧甲基纤维素（carboxymethylcellulose，CMC）均具有高度生物相容性与可降解性，是制备DMNs的绝佳材料，有研究表明以其为基质材料制备的微针负载蛋白类药物不会影响其药效[20]。硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）是关节炎治疗中常用的营养补充剂，患者耐受性好，副作用小，药物相互作用少；还可减少刺激加速皮肤愈合，增加微针生物相容性[21-22]。
本实验以PVP、CMC和CS制备载NT的DMNs（DMNs-NT），正置光学显微镜表征、HPLC考察载药量及皮肤的透皮性能，为多肽及大分子药物经皮递送研发提供理论依据。
1 仪器材料
1.1 仪器
微针模具，台州薇凯生物科技有限公司；HF-50数显推拉力计、HLX-S推拉力计测试机架，美国PACK公司；B008便携式显微镜，深圳超眼科技有限公司；TL6R立式低速冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；TGL-16G台式离心机，上海安亭科学仪器厂；DZF-6050真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；Labconco冷冻干燥机（4.5 L台式），美国Labconco公司；Nikon Eclipse Ci-L正置显微镜，日本尼康株式会社；Waters Alliance e2695高效液相色谱仪，美国Waters公司；CP225D型电子分析天平，德国Sartorius公司。
1.2 药品与试剂
NT，质量分数＞97%，云南龙凤谷生物药业有限公司，批号H45021228；CS，郑州欧泰化工产品有限公司，批号170801；PVP K30，美国Sigma- Aldrich公司，批号BCBP9635V；CMC，国药集团化学试剂有限公司，批号C10085620；实验用水为去离子水，其他试剂均为分析纯。
1.3 实验动物
Wistar大鼠，体质量（180±20）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，合格证号SCXK（沪）2017- 0005。
2 方法与结果
2.1 微针的制备
经过前期预试验，采用两步离心法[23]制备DMNs-NT。第1步，微针头的制备：按一定比例分别称取CS与PVP K30于烧杯中，加入一定量NT的水溶液，充分溶解并搅拌均匀。将含药的基质液注入微针模具中，在4 ℃条件下，4 000 r/min （3 580×g）离心10 min，除去并收集微针模具表面的含药基质液，放入干燥器中干燥1 h后取出备用；第2步，微针背衬层的制备：称取适量CMC，溶于去离子水，搅拌均匀后注入微针模具，相同条件下离心10 min，取出具有含药基质液的微针模具干燥成形，用弯镊小心脱模，即得DMNs-NT。微针模具放入热水中超声清洗后，放入真空干燥箱干燥，重复利用。
2.2 NT分析方法的建立
2.2.1 色谱条件 色谱柱为CNW AthenaC18-BIO（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B：0.1%三氟乙酸乙腈溶液；梯度洗脱：0～10 min，10%～27% B；10～12 min，27% B；12～15 min，27%～10% B；15 min，10% B；体积流量0.9 mL/min；检测波长200 nm；进样量20 μL；柱温30 ℃。理论塔板数≥5 000，分离度＞1.5。
2.2.2 对照品溶液的配制 精密称取NT对照品2.02 mg，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，转移至10.0 mL量瓶中，用PBS润洗3次至量瓶，加至刻度，摇匀，即得对照品储备液（质量浓度为202.00 μg/mL）。
2.2.3 专属性试验 取DMNs-NT溶解配制成溶液，与NT对照品储备液过0.45 μm微孔滤膜，按“2.2.1”项下条件进样测定。结果（图1）表明，NT峰形良好，基质材料对药物测定无干扰，方法具有良好的专属性。
2.2.4 线性关系考察 精密取对照品储备液，加pH值为7.4的PBS分别稀释成151.50、101.00、75.75、50.50、20.20、10.10 μg/mL的溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别进样。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得回归方程为Y＝35 624 X－69 232，r＝0.999 8。表明NT在10.10～202.00 μg/mL线性关系良好。
2.2.5 精密度试验 分别取NT对照品溶液151.50、50.50、20.20 μg/mL，按“2.2.1”项下色谱条件1 d内分别测定5次，连续测定3 d。结果表明，NT低、中、高质量浓度溶液的日内精密度RSD分别为0.95%、1.10%、1.32%；日间精密度RSD分别为1.76%、1.14%、1.08%%，日内和日间精密度RSD均符合要求，该方法精密度良好。
2.2.6 重复性试验 取DMNs-NT 6份，分别溶解配制成质量浓度约为50.00 μg/mL的供试品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，按“2.2.1”项下色谱条件测定质量浓度。结果表明，NT实际质量浓度平均值为（50.60±0.66）μg/mL，RSD为1.30%，该方法重复性良好。
2.2.7 稳定性试验 取DMNs-NT溶解配制成药物质量浓度为50.00 μg/mL的供试品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，按“2.2.1”项下色谱条件测定质量浓度。结果表明，NT实际质量浓度平均值为（49.91±0.79）μg/mL，RSD为1.59%，表明DMNs-NT供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.2.8 加样回收率试验 取DMNs-NT 9份分别溶解配制成药物质量浓度为50.00 μg/mL的供试品溶液，分别加入同体积质量浓度为40.40、50.50、60.60 μg/mL的对照品溶液，过0.45 μm的微孔滤膜，按“2.2.1”项下色谱条件测定质量浓度。以计算的质量浓度值和真实质量浓度值之比计算加样回收率。结果显示低、中、高质量浓度的加样回收率分别为（99.84±1.07）%、（100.40±1.42）%、（96.77±0.76）%，RSD分别为1.07%、1.41%、0.79%，结果表明加样回收率符合方法学要求。
2.3 微针制备条件的优化
以微针的成形性、机械强度及背衬层的柔韧性为指标，单因素考察CS与PVP k30的比例、基质液的含水量、背衬层的材料。
2.3.1 CS与PVP K30的比例 前期研究表明在基质液CS中加入PVP K30可以提高所制备DMNs- NT的机械强度，优选CS与PVP K30最优配比。分别以CS与PVP K30配比1∶0、5∶1、3∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2，按照“2.1”方法，基质材料与加水量的比例5∶4，制备DMNs-NT，显微镜下观察其成形性，并采用HF-50数显推拉力计测定其机械强度（纵向与横向的断裂力）。结果如表1所示，以CS与PVP K30配比为1∶1制备的DMNs-NT成形性和机械强度最优。
2.3.2 加水量的确定 在DMNs-NT制备的过程中，需要向CS与PVP K30的基质液中加入适量水，而加水量会直接影响所得DMNs-NT的机械强度，考察基质材料与加水量最优配比。基质材料与加水量的比例（质量比）分别为3∶5、4∶5、1∶1、5∶4，按照“2.1”项方法，CS与PVP K30配比为1∶1，所示，基质材料与加水量的比例5∶4时，基质溶液的流动性适宜，所得DMNs-NT的机械强度最好。
2.3.3 微针背衬层材料的选择 在DMNs-NT制备的过程中，选择不同材料制作DMNs-NT的背衬层会影响最终制剂的柔韧性，因此本实验考察不同材料对最终制剂柔韧性的影响。分别以PVP K30 500 mg、CS 800 mg、CMC 30 mg为背衬层材料与1 mL水混合均匀，其他条件相同制备DMNs-NT，分别记录其柔韧性。结果如图2所示，以CMC为材料制作的背衬层柔韧性最佳。
2.3.4 微针制备最终方案 按1∶1的比例分别称取CS与PVP K30各500 mg于烧杯中，加入5 mg/mL的NT水溶液0.8 mL，充分溶解并搅拌均匀。将含药的基质液注入微针模具中，在4 ℃条件下，4 000r/min离心10 min，除去并收集微针模具表面的含药基质液，放入干燥器中干燥1 h后取出备用。称取150 mg CMC，溶于5 mL去离子水，搅拌均匀后注入微针模具，相同条件下离心10 min，取出具有含药基质液的微针模具后放入干燥器中，干燥24 h后取出，用弯镊小心脱模，即得DMNs-NT。
2.4 微针的表征
2.4.1 微针机械强度 以最终优化的制备方案参照“2.3.4”方法制备DMNs及DMNs-NT，用HF-50数显推拉力计测定其纵向与横向的断裂力以确定机械强度。所得DMNs纵向与横向的断裂力分别为（0.20±0.01）、（1.47±0.09）N，而DMNs-NT则为（0.20±0.01）、（1.51±0.11）N，两者差异无显著性（P＞0.05）。
2.4.2 微针含药量测定 将DMNs-NT溶于1 mL去离子水中，提取10 min后，以8 000 r/min离心，5 min后取上清液过0.45 μm微孔滤膜，按“2.2.1”项下色谱条件测定其含药量，所得每片DMNs-NT含药（15.4±0.5）μg。
2.4.3 微针形态特征 将所制备的DMNs-NT置于正置光学显微镜下观察其不同角度的外观形态。结果如图3所示，DMNs-NT针体呈四棱锥形，表面平整，长度约为500 μm，底部宽度约为300 μm，中心间距约为900 μm。
2.4.4 微针的稳定性 将制备的DMNs-NT分别在−20、4 ℃及常温条件下分别存放1、2、3个月，用HPLC测定其剩余含药量。结果如表3所示，在同种条件下，保存时间越长DMNs-NT中含药量越低。而在不同条件下保存相同时间，在−20 ℃条件下DMNs-NT中含药量最高，NT含量变化程度最小。可见，DMNs-NT的稳定性良好且更适合储存在低温环境中。
2.5 微针体外皮肤渗透实验
取雌性Wistar大鼠，ip戊巴比妥（50 mg/kg），待大鼠麻醉后，先用小动物剃毛器剃去大部分鼠毛，再用电动剃须刀剃去剩余鼠毛，取下皮肤，剥离脂肪组织和筋膜，用生理盐水反复清洗后，用滤纸吸干，再用锡箔纸包裹后，放入−80 ℃冰箱。使用时，从−80 ℃冰箱取出锡箔纸包裹的皮肤，小心打开，取出皮肤，放入生理盐水浸泡30 min后使用。
向Franz扩散池的接收室内注入pH值为7.4的PBS作为接收液，同时超声排出接收室内多余的空气。将制得的DMNs-NT置于处理好的离体大鼠皮上并施加一定力度的力，1 min后用医用胶带固定，处理过程中须保证皮肤的完整性。处理完成后将皮肤置于8 mL接收室上，皮肤角质层朝上，皮肤组织朝向接收室，保证皮肤的有效扩散面积均与接收液的液面相接触，同时另设一组给予NT溶液。固定好供给池和接收室后将扩散池置于恒温磁力搅拌器上，以600 r/min的转速模拟人体皮肤下的血液和组织液内循环，保持温度在32 ℃恒温。分别于透皮0、10、20、30 min及1、2、3、4、6、8 h后收集0.5 mL接收液作为样品进行含量测定，取样后及时补充等量的新鲜接收液。
将取出的接收液样品以0.45 μm微孔滤膜进行滤过，按“2.2.1”项下色谱条件测定，SPSS17数据处理，绘制药物的累积渗透曲线。结果如图4所示，前20 minDMNs-NT中的NT较少透过皮肤，累积渗透率为12.1%，而1 h后透过皮肤的NT的累积渗透率已大于50%，4 h后达到90%以上。本实验中的NT溶液组由于未在实验过程中测到，故认为NT几乎没有透过皮肤。
3 讨论
本实验旨在通过DMNs荷载，将NT蛋白多肽类经皮给药达到无痛给药并缓释的目的。采用两步离心法制备了DMNs-NT，其由微针针头与背衬层2部分构成。微针头的主要组成材料为CS与PVP K30，其中含有药物NT，背衬则由CMC构成。采用两步离心法成功制备了DMNs-NT，并进行了制备条件的优化。微针头呈四棱锥形，针与针之间差异小，机械强度良好。有研究表明相比于其他形状的微针，四棱锥形的微针能够更好地穿透SC，使药物透过皮肤[19]，有助于NT的溶解及在体释放。
DMNs主要依靠在SC上形成通道并最终使针头部分在皮肤中溶解，从而释放出药物NT发挥作用。因此，微针头必须具有良好的成形性与机械强度以保证其能顺利刺入皮肤而不变形。微针头在刺入皮肤过程中不仅仅受到轴向的作用力，而且会有一个垂直于针体的弯曲力。因此，确定CS与PVP K30的比例、基质材料与加水量比例这2个条件时综合考虑，兼顾轴向的作用力与垂直于针体的弯曲力，最终确定CS与PVP K30的比例为1∶1、基质材料与加水量的比例为5∶4。而背衬层的柔韧性关乎DMNs-NT给药时能否很好地贴合皮肤，对DMNs-NT能否更好发挥疗效产生影响。与CS、PVP K30相比，以CMC为材料的背衬层可以很轻松地弯曲，更适合本研究的要求。
DMNs-NT在体外透皮实验过程中，前20 min透过皮肤的NT不到20%，之后其透皮速率加快，1 h后NT的累积渗透率已大于50%，4 h后达到90%以上，表现出对NT的缓释作用。NT溶液组在释放介质中未检测到。NT这种大分子多肽很难穿透皮肤，DMNs可以显著提高NT的透皮递送量。DMNs可有效荷载NT类多肽药物，显示出良好的机械强度，可通过透皮方式给药，实现无痛给药及缓释作用；且DMNs将NT固化在可降解材料中，使DMNs中的NT具备优越的稳定性。
参考文献（略）
来 源：夏爱晓，姚文栋，陈晓劼，蒋正立，李范珠. 中华眼镜蛇神经毒素可溶性微针的制备及体外经皮渗透性研究 [J]. 中草药, 2020, 51(3):625-630.
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