摘 要：甘草Glycyrrhizae Radix et Rhizoma是中医临床常用中药之一，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功能。其主要活性成分为皂苷、黄酮、多糖等。其中，皂苷类成分甘草酸、甘草次酸不仅对肝癌、肺癌、乳腺癌等多种癌症具有抑制作用，还能与化疗药物联用增加药效，同时可被开发用作药物递送的载体材料以解决药物低水溶性、低生物利用度、高毒副作用等问题。研究发现，甘草酸、甘草次酸的增溶作用可能与其两亲性结构有关，有望进一步探索它们作为药物跨膜运输载体的特性。基于甘草的抗肿瘤机制，系统地对甘草酸、甘草次酸在药物递送系统方面的应用进行综述，为开发甘草酸、甘草次酸作为药物递送系统辅料的深入研究提供参考。
甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草G. inflate Bat. 或光果甘草G.glabra L. 的干燥根茎，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功能，主含皂苷类、黄酮类、多糖类[1-2]等成分。其中，皂苷类成分主要包括甘草酸（glycyrrhizic acid，GL，图1-A）与甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA，图1-B），均属齐墩果烷型五环三萜皂苷，具有抗炎、抗癌、抗菌等作用[3-5]。研究发现，GL、GA具有皂苷类两亲性物质的结构特点，能与细胞膜上胆固醇或磷脂相互作用，因此其可以作为药物跨膜运输的理想载体材料[6-11]。本文主要对GL、GA的抗肿瘤机制、其作为药物递送系统的运输机制及应用进行综述，为基于GL、GA的药物递送系统发展提供参考依据。
1 GL与GA抗肿瘤作用及其机制
肿瘤发生与细胞增殖、凋亡调控等密切相关，凋亡机制的异常可能是肿瘤发生的重要原因。研究发现，GL、GA主要通过调控细胞周期、凋亡信号等机制发挥抗肿瘤作用。
1.1 对白血病细胞的抑制作用
白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，与细胞异常增殖、自噬、凋亡等密切相关[12]。GL是一种理想的白血病治疗药物，He等[13]发现100 mg/kg GL能下调人血液白血病细胞（TF-1）中蛋白激酶B（Akt）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、信号转导与转录激活子3（STAT3）磷酸化水平，可通过阻断Akt/mTOR/STAT3信号通路抑制体内肿瘤细胞生长。Chueh等[14]研究了GL对小鼠白血病细胞WEHI-3的抗白血病作用，结果表明GL能促进细胞系中凋亡诱导因子（AIF）、细胞色素C、内切酶G的转运，提高活性氧（ROS）含量，刺激半胱天冬酶-3（caspase-3）活性，进而引起G0/G1细胞周期阻滞、肿瘤细胞形态学改变，促进其凋亡。Pirzadeh等[15]采用流式细胞术观察到GA能以剂量依赖的方式上调人白血病细胞HL-60表面CD95和CD178的表达，引起细胞凋亡。张金玲等[16]采用MTT法、明胶酶谱法及Transwell小室基质凝胶侵袭实验，证明GA能下调白血病细胞（K562、HL-60）明胶酶A、B的活性，从而抑制K562、HL-60细胞增殖。
1.2 对肝癌细胞的抑制作用
肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，死亡率极高，严重威胁人类生命健康。其发生机制与原癌基因突变及肿瘤抑制基因异常有关。Zhang等[17]提出GL的抗癌作用可能与其诱导癌细胞自噬有关。在GL诱导的肝癌细胞（HepG2、MHCC97-H）自噬和细胞毒性研究中发现，Akt/mTOR信号通路受到抑制，细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）活性得到增强，进而抑制肿瘤细胞生长。Tang等[18]通过细胞自噬染色检测试剂盒（MDC）法分析发现，GA能通过激活ERK、增加乳酸脱氢酶释放，降低了肝癌细胞（HCC）的活力，引起HCC保护性自噬，诱导细胞凋亡。张韫琪等[19]利用GA处理4种不同增殖速率的肝癌细胞（SMMC-7721、SK-HEP1、HEPG2、HEP3B），发现GA能剂量依赖性地抑制上述4种肝癌细胞的体外增殖，增殖率与细胞内ERK的磷酸化、拓扑异构酶IIα的表达呈正相关。Kuang等[20]研究表明GA通过减少T细胞凋亡及调节性T细胞的表达，来逆转肝星状细胞（HSCs）介导的免疫抑制作用，从而增强T细胞攻击肿瘤细胞和减弱肝癌细胞侵袭的能力。此外，还利用免疫功能正常的C57BL/6小鼠的肝癌原位移植模型验证了GA可通过减少肿瘤微环境中HSCs介导的免疫抑制，进而控制肝癌的发生。
1.3 对肺癌细胞的抑制作用
1.4 对结肠癌细胞的抑制作用
1.5 对乳腺癌细胞的抑制作用
研究表明，GL、GA对人乳腺癌具有抑制作用，其主要机制涉及细胞凋亡、通路阻断等。Lin等[28]发现GL通过ROS-线粒体途径诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡和自噬。高砚春等[29]采用半定量逆转录-聚合酶联反应（RT-PCR），发现随GL浓度增加和作用时间延长，MDA-MB-231细胞中Fas、survivin、Bax、caspase-3基因表达降低，Bcl-2基因表达上升。Fas、survivin、Bax、caspase-3、Bcl-2等基因均与细胞凋亡、增殖关系密切。Survivin是细胞凋亡抑制因子，能够阻止Fas介导的细胞凋亡；Bcl-2是抑制细胞凋亡的特异性基因，可阻止激活或抑制与凋亡相关的基因表达；Bax对Bcl-2有拮抗作用，促进细胞凋亡。该研究证明GL对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖抑制作用强，且具有明显的量效和时效关系。Wang等[30]研究发现GA能特异性抑制p38 MAPK的活性及其下游激活蛋白-1（AP1）的活化能力，抑制乳腺癌细胞MMP-2/ MMP-9表达，下调乳腺癌细胞中AP1转录复合物两大主要成分（Fra-1、c-Jun）的表达，表明GA能通过破坏p38MAPK-AP1信号通路抑制乳腺癌细胞的侵袭。Sharma等[31]研究发现GA介导的线粒体死亡级联反应对乳腺癌MCF-7细胞的生长产生抑制作用，主要表现为磷脂酰丝氨酸外化、DNA片段化、线粒体膜电位丢失、细胞色素C释放及caspase-9活化。研究发现，GA通过活化caspase和调控Akt/FOXO3a（由FOXO3基因编码的人类蛋白质）通路诱导MCF-7细胞凋亡。
1.6 对卵巢癌细胞的抑制作用
卵巢癌是致死率最高的女性生殖系统疾病，研究表明，GL、GA对卵巢癌具有一定抑制作用。Takeuchi等[32]发现GL、GA能显著降低睾酮的分泌，影响4-雄烯二酮与睾酮的转化，刺激芳香化酶活性，促进雌二醇合成，可用于缓解卵巢机能不全或卵巢激素不足引起的如功能性子宫出血、原发性闭经等卵巢癌早期潜在症状。Haghshenas等[33]通过人卵巢癌细胞A2780的体外细胞毒性实验，发现GA以剂量依赖性的方式上调A2780细胞的Fas和FasL水平，诱导A2780细胞凋亡。GA可通过对线粒体介导的细胞死亡通路的激活，增强曲古菌素A对卵巢癌细胞的促凋亡作用[34]。Yang等[35]发现GA能通过激活caspase-8及线粒体介导的细胞死亡通路，增强对热休克蛋白90（Hsp90）的抑制作用，诱导卵巢癌细胞凋亡，有助于卵巢上皮腺癌的治疗。
1.7 对其他癌症细胞的抑制作用
GL、GA在其他癌症中也发挥重要作用，在各种信号通路中占有重要地位。GL能抑制人胶质母细胞瘤U251细胞增殖并诱导细胞凋亡，其可能与NF-κB介导的通路有关[36]。GL呈剂量依赖性地降低宫颈癌HeLa细胞活力，可作为一种辅助手段用于宫颈癌治疗[37]。GA能通过内质网膜蛋白肌醇酶1（IRE1）-JNK通路诱导内质网应激刺激细胞自噬，降低肉瘤生长，且对其他器官几乎没有毒性[38]。Cai等[39]发现GA能上调E-钙黏素（E-cadherin）表达，下调波形蛋白表达，以剂量依赖性的方式抑制MMP-2、MMP-9的活性，抑制ROS的生成、PKC的表达和ERK的磷酸化，通过ROS/PKC-α/ERK信号通路抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。
2 GA与GL作为药物递送系统的机制
2.1 直接跨膜的递送机制
大量研究表明[40]，经GL、GA修饰的新型药物制剂能显著增加药物的溶解度和生物利用度，在病变部位的高度积累可能与其直接跨膜作用密切相关。Nicol等[41]利用α-常春藤皂苷（α-hederin）包载聚集诱导发光（AIE）材料进行体内递送，发现AIE能够被细胞高效快速地摄取。同时，Nicol等[42]制备了包载AIE的皂苷（quillaja）纳米粒，发现其能够穿过以阿拉伯芥为植物模型的细胞壁并定位在质膜上。Wang等[43]将鬼臼毒素（podophyllotoxin）包封于GL胶束，可增加药物在表皮细胞内的分散。由此可见，皂苷作为载体递送药物可与细胞膜产生相互作用。皂苷的跨膜特性与其两亲性结构相关，皂苷能与细胞膜上的胆甾醇或磷脂相互作用，引起脂质流动性变化，诱导孔隙形成，增加细胞膜渗透率[9]。皂苷与膜相互作用具有浓度依赖性，当浓度小于临界胶束浓度（CMC）时，皂苷单体将嵌入并结合到膜外层的甾醇；当浓度高于CMC时，皂苷将直接诱导膜孔的形成，导致膜电位的暂时丧失，表明胶束（或聚集体）能直接与膜相互作用，并向膜附近释放大量皂苷（图2）。Selyutina等[6]采用动态核磁共振和分子动力学模拟实验研究GL与POPC脂质体、模型双层膜（DPPC、DOPC）的相互作用，结果表明GL能穿透脂质双分子层，引起脂质流动性变化，促使形成孔隙。Shelepova等[8]采用分子动力学模拟发现GL与脂质双层膜中胆固醇结合，在膜中诱导产生孔隙，引起膜通透性增强。Fu等[44]揭示了GL通过激活人源脂类外向转运蛋白（ABCA1），诱导脂筏胆固醇流出，降低脂筏胆固醇含量。[45]。实验结果表明在一定条件下GL、GA依然安全可靠，并不会发生溶血。杜洪亮[46]通过控制投料比，制备出不同浓度和不同GA取代度的低相对分子质量肝素（LMWH-GA）聚合物胶束。结果显示，聚合物的溶血程度随GA取代度的增加而增大，且呈现出浓度依赖性。当质量浓度为1、2 mg/mL时，溶血比率分别为1.61%、4.32%。且GA取代度为7.47的聚合物促红细胞溶血率低于5%，符合国家静脉注射标准[47]。因此，合理控制GA与GL浓度和取代程度，可安全用于药物递送领域。利用皂苷直接跨膜的递送机制开发其为药物载体，将成为未来药剂发展的研究重点。
2.2 靶向递送机制
3 GL与GA在药物递送系统中的应用
纳米药物递送系统是药剂工作者研究的热点，作为新型药物递送系统，其虽在一定程度上可通过增加药物溶解度、提高渗透性等方式来提高药物传递效率，但目前该药物传递系统的设计仍存在不足。[56-57]。因此，运用新型功能性载体材料或针对性地对其进行化学修饰，已成为新型药物递送系统设计的突破点。然而目前药物载体材料的开发及化学修饰的研究中，大多以人工合成分子为主，均存在一定缺陷。这些新材料或新分子本身需经过严格的临床试验和最终的FDA批准才能用作新辅料，会耗费大量时间精力，且它们在生物相容性和安全性等方面无法与天然物质相媲美。因此，发现及开发合适的天然药物载体将成为未来药剂学的研究热点与重点。
3.1 纳米粒的修饰
在药物传输领域系统一般将纳米粒的尺寸界定在1～1 000 nm[73]。其粒径小、分散度大，能显著增加药物溶解度，提高难溶性药物的生物利用度。但由于纳米粒比表面积大、表面原子数多、表面能高，使得这些表面原子具有很高的活性，极不稳定，纳米粒在制备、储存以及使用过程中便容易发生团聚或与其他物质发生吸附而失活，因此对纳米粒进行表面修饰尤为重要。此外，为了改善纳米粒的靶向性，也极有必要对其进行修饰，使药物载体能将药物定向地运送到靶组织并发挥药效。
3.1.1 白蛋白（BSA）纳米粒 BSA是一种主要来源于血液的内源性大分子，一级结构中有大量的氨基酸残基，为一些小分子（配体）提供结合位点。其具有无毒性、生物可降解性等优良特性，常被选作药物载体，目前，已有上百种药物以牛血清BSA为载体被用于药物运输。研究发现，经GL修饰的牛血清BSA具有更好的靶向性和稳定性，能显著增加细胞内药物浓度。Mao等[74]用GL修饰钙素负载的牛血清BSA纳米粒（Cal-BSA-NP-GL），发现Cal-BSA-NP-GL对大鼠肝细胞摄取量为无GL修饰的纳米粒（Cal-BSA-NP）的4.43倍。Zu等[61]利用高压均质乳化法制备GL偶联BSA纳米粒荷载10-羟喜树碱（HCPT）（GL-BSA-HCPT-NPs），结果显示GL-BSA-HCPT-NPs水溶液稳定性良好，具有肝癌细胞靶向性且有缓控释效果。He等[75]制备了GA修饰的BSA纳米粒负载恩替卡韦（ETV-GA-AN），发现GA修饰的纳米粒显著增加了恩替卡韦在肝癌细胞中的蓄积，并能够抑制特定外排转运体的活性。
3.1.2 壳聚糖（CS）纳米粒 CS是甲壳素脱乙酰化得到的产物，是自然界天然多糖中唯一的碱性多糖，具有环保无毒、来源丰富、生物相容性好等优点，被广泛用作新型给药系统的载体材料。但CS仅能溶于酸性溶液，应用受到较大限制，故有必要对CS进行功能化修饰来扩大其应用范围。壳聚糖结构中C-2位氨基和C-3、6位羟基是主要的修饰位点，可分别引入聚乙二醇、羧甲基、季按盐等亲水基团和长链烷基、酰基、芳基等疏水基团制成两亲性聚合物。因在水溶液中可自组装形成特殊的壳状结构纳米粒，故可用作难溶性药物、生物大分子蛋白质等的递送载体，提高药物功效[76]。通过在CS表面接枝GL，制备出了由GL修饰的CS纳米粒（CS-NPs-GL），其包封率（91.7±3.2）%比CS-NPs（65.5±2.1）%更高，且呈现出更慢的体外释放速率。通过荧光标记该纳米粒，结果显示CS-NPs-GL能优先聚集在肝细胞，且在肝实质细胞中摄取率是非实质细胞的4.9倍[77]。O-羧甲基壳聚糖经GL修饰后制成的纳米粒包裹紫杉醇（PTX）能够保护药物的稳定性，延长药物在体内的循环时间，有效提高药物利用度[62]。GA修饰后的硫酸壳聚糖包载阿霉素（DOX）胶束（DOX/SA-SCTS）对肝癌HepG2细胞的亲和力比正常肝细胞（人张氏肝细胞）高近2.18倍[78]。Chen等[79]发现GA偶联的硬脂酸接枝壳聚糖（GA-CS-SA）的CMC（17.49 mg/mL）比硬脂酸接枝壳聚糖（CS-SA）的CMC（23.20 mg/mL）低，说明GA-CS-SA胶束核-壳结构更为稳定，是极具潜力的抗癌药物载体。
3.1.3 透明质（HA）酸纳米粒 HA是一种在生命[80]设计合成了透明质酸-己二酰肼-脱氧胆酸（HA-adh- DOCA）和透明质酸-己二酰肼-甘草次酸（HA-adh- GA）2种两亲性HA衍生物。2种载药胶束的血药时间曲线下面积较混悬剂相比更大，表明前者进入体内循环的药物相对量更大，即制剂中的药物被生物体吸收越完全。以包载的近红外荧光染料（DiR）为指示剂，通过荧光成像分析胶束在经CCl4诱导的急性肝损伤小鼠体内的生物分布。根据荧光成像，在测试的各个时间点，HA-adh-GA胶束在肝脏中均表现出比HA-adh-DOCA胶束更强的荧光信号，表明含GA的胶束可以辅助水飞蓟宾靶向肝脏器官，以提高水飞蓟宾的保肝作用。Wang等[81]制备了负载DOX的透明质酸-甘草次酸琥珀酸偶联纳米粒（HSG/DOX），发现其可延长DOX的血液循环时间，显著增加药物的积累并降低肝脏和肾脏毒性。
3.1.4 两亲性聚合物 Ma等[82]合成了一种两亲性均聚物聚甘草酸（PGly），该均聚物乳液的粒径分布和分散状态可以通过pH（2.0～5.0）进行可逆调节，具有良好的表面活性和多种pH响应性，其在农药制剂的控释和有机污染的回收方面具有广阔的应用前景。Yang等[83]制备了一种经GA修饰的聚乙二醇（PEG）衍生聚合物前药胶束（PEG-Fmoc-GA），发现PEG-Fmoc-GA聚合前药胶束与DOX合用可抑制和诱导细胞凋亡，促进细胞内DOX的摄取并显著增加血液循环时间。Huang等[84]制备出GA修饰的负载DOX的PEG聚合氨酸苄酯（PBLG）胶束，发现DOX/GA-PEG-PBLG胶束在肝脏中相对摄取远大于其他组织，DOX浓度约为未修饰胶束的2.2倍。Chen等[85-86]制备了GA-聚乙二醇-接枝聚乳酸-共乙醇酸聚合物胶束（GA-PEG-SS-PLGA），结果表明经GA修饰的聚合物胶束通过上调细胞内ROS水平、增加细胞S期阻滞、上调P38蛋白表达，对HepG2细胞具有促凋亡作用。Zhu等[87]用GA修饰的D-α-生育酚琥珀酸聚乙二醇1000聚合物胶束（TGA PMs）运输依托泊苷（ETO），发现GA修饰的聚合物胶束能更多地在肝癌细胞中表达。Zhang等[88]发现经GA修饰的转录肽反式激活剂（TAT）和pH敏感性聚β-氨基酯聚合物胶束能更多地在肝部位积累。Liu等[89]制备了用聚乙二胺和GA修饰的氧化石墨烯（GO-PAMAM-GA），发现经过GA修饰的聚合物具有更强的生物相容性和靶向能力。
3.2 纳米粒的稳定剂
药物的治疗效果与纳米粒的稳定性具有很大联系，研究表明，GL能在0.01～1mmol/L低浓度范围内形成二聚体，在1 mmol/L浓度之上形成胶束[90]。GL修饰的纳米粒具有良好的稳定性，可用于包载多种药物。GL修饰的壳聚糖-阿拉伯树胶聚合物纳米粒具有更好的稳定性[91]。Chen等[92]用难溶性药物穿心莲内酯（AGE）为模型药物，以GL为天然稳定剂，采用高压均质法制备了平均粒径为487 nm的AGE纳米混悬剂（AGE-NS），并用冷冻干燥法将其转化为干燥的AGE纳米混悬剂粉末（AGE-NP）。结果表明，GL能防止纳米晶体聚集，冻干后的AGE-NP易再分散到AGE-NS。这与GL的特殊界面性质和静电效应 [（−43.6±0.9）mV]
3.3 包合物
包合物系指一种分子被全部或部分包合于另一种分子的空穴内形成的特殊络合物，药物经包合能增效减毒、提高稳定性和生物利用度。钙通道阻滞剂硝苯地平（NF）被GL络合后形成的复合物具有很好的稳定性[95]。Wang等[43]采用超声法制备了GL包载的鬼臼毒素（POD），发现经GL包封的POD能减少白细胞侵袭和炎症因子（IL-6、TNF-α）的表达，且其在皮肤的累积量 [（24.37±0.97）μg/cm2]高于POD酊剂 [（20.07±1.02）μg/cm2]。Lin等[68]采用薄膜水化法将GA、丹参酮IIA（TSN）、丹酚酸B（Sal B）共包入脂质体（GTS-Lip），发现GTS-Lip能抑制肝星状细胞的增殖。
3.4 其他
Tong等[96]以GL、藻酸盐和钙为原料，制备了一种可降解的原位注射水凝胶用于三维细胞培养，GL作为修饰剂、调节剂能辅助水凝胶较长时间维持细胞的活力。GA的C-3位和C-30位经过一定的修饰，能与β-环糊精共价耦合，得到的偶联物具有良好抗病毒活性，并可作为一种先导化合物用于开发潜在抗流感病毒药物[97]。Singh等[98]合成了一种经GA修饰的小分子结合物，用于pH触发的近红外（NIR）荧光成像检测肝癌。该结合物被称为NIR-GA，主要定位于溶酶体。在酸性介质中，NIR-GA能在NIR区产生强荧光，可通过GA受体介导的内吞途径被肝癌细胞系（HepG2、Huh7）有效摄取而不影响细胞活性。
4 结语与展望
随着技术的发展，寻找天然药物活性成分实现“药辅合一”的研究工作时不我待。GL、GA作为甘草提取物的主要活性成分在药理学上表现出广泛的活性。尽管目前对GL、GA在抗肿瘤方面的研究已有许多报道，但大多还只停留在其对肿瘤细胞的直接作用。GA在水中溶解度虽不理想但其对肝脏有较强的靶向性；GL虽在胃肠道吸收较少，有首关效应，但其作为两亲性物质可与一些难溶性药物联用。基于它们各自的理化性质，可考虑将GL、GA作为递送系统的载体对药物进行递送。
GL、GA作为载体材料，不仅安全无毒，在肿瘤治疗过程中能与其他化疗药物协同发挥抗肿瘤作用。GL、GA可通过不同机制抑制肿瘤细胞生长，它们的作用靶点出现于多种癌细胞，其为GL、GA与核心治疗药物的选择性搭配提供了可能性。由GL、GA修饰的药物递送系统或它们与抗癌药物形成的复合物，相比传统的游离药物或普通剂型而言，大多在体内外都能表现出更低毒副作用及更强的药效。其有望被开发为药辅合一的药物递送系统，进一步提高药物的生物利用度及治疗活性。但目前阶段，对甘草酸、甘草次酸跨膜特性及其作为药物递送系统的作用机制的研究还相对较少，多停留在体外模型，故有待进一步深入研究以探索其丰富的药物载体性能，发挥更大作用，为药物递送系统研究提供依据。
参考文献（略）
来 源：王若宁，柳雨影，陈 健，王洪兰，李俊松. 甘草酸、甘草次酸的抗肿瘤机制及其作为药物递送载体的研究进展 [J]. 中草药, 2019, 50(23):5876-5886.
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