海马补肾丸质量标志物研究

摘 要：海马补肾丸为中药大品种，疗效确切，但其基础研究薄弱，质量控制方法简单，不能科学评价和有效控制该药的质量。基于中药质量标志物的理念和确定原则，对其化学物质组及口服血行成分进行了辨识与表征，进而通过整体动物模型、蛋白组学、代谢组学、网络药理学以及受体结合及酶学检测等方法，评价其有效性、阐释作用机制、确定药效物质基础、提炼质量标志物，为充分发挥该药的临床价值、建立科学的质量评价体系提供了理论和实验依据。

海马补肾丸是天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂独家产品，由海马、熟地黄、鲜雀肉、淫羊藿、人参等36味中药组成，其中包含动物药11味，植物药25味；具有滋阴补肾、强身健脑之效，用于身体衰弱、气血两亏、肾气不足、^[1]，因其具有与中药有效性密切关联、指标成分特异专属、可传递与溯源以及从中医药配伍环境出发等特点，极大地提高了中药质量评价科学性与完整性，能更有效地提高中药质量控制水平和有利于建立中药质量溯源体系。本文对海马补肾丸制剂的化学物质组及口服血行成分进行了辨识与表征，进而通过整体动物模型、蛋白质组学、代谢组学、网络药理学以及受体结合及酶学检测等方法，评价其有效性、阐释作用机制、确定药效物质基础、提炼质量标志物，以期为提升其质量标准提供理论和实验证据。

1  海马补肾丸中化学物质组表征和辨识

1.1  制剂中原型物质组的辨识与表征

海马补肾丸为由36味中药组成的大复方，化学物质组的辨识与表征是揭示该药科学内涵的前提和必要条件，也是确定质量标志物的基础。本课题组从海马补肾丸中共表征辨识出320个化合物，其中挥发性成分105个、非挥发性成分215个，另外还有21种无机矿物质元素。

采用GC-MS技术方法，优化色谱-质谱检测条件，对海马补肾丸挥发性成分进行分析研究。从海马补肾丸中共辨识得到105个挥发性化合物，主要为烯烃类、醇类、酮类、脂肪酸类及脂肪酸酯类等成分，其中茴香脑、丁香酚、石竹烯、2′,3′,4′-三甲氧基苯乙酮、棕榈酸、十四酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、软脂酸乙酯等含量较高。

运用RP-LC-MS和亲水作用色谱（HILIC）-LC- MS的技术方法，分别对海马补肾丸非挥发性成分进行分析研究。在海马补肾丸中共鉴定得到215个非挥发性化合物，主要为磷脂类、有机酸类、生物碱类、苯乙醇苷类、木脂素类、黄酮类、三萜皂苷类及氨基酸等成分。进一步结合文献进行成分的药材来源归属，其中来源于人参10个、熟地黄8个、山茱萸5个、补骨脂14个、附子23个、黄芪5个、当归10个、枸杞子1个、淫羊藿34个、肉苁蓉17个、狗脊3个、杜仲10个、党参4个、茯苓1个、覆盆子15个、五味子14个、肉桂1个、茴香3个、母丁香1个、牛膝2个、甘草14个，动物药海马、鹿茸、狗肾、驴肾、鲜雀肉、鹿筋、干海米、海蛆、蛤蚧主要为磷脂、氨基酸及核苷类等成分。

采用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）对海马补肾丸成品制剂中21种无机矿物质元素进行定量研究，通过分析各元素在全方中的比重，发现钙元素占全方无机矿物质元素总量的40%以上，主要来源于龙骨、豹骨等动物药。钾、磷、钠元素质量分数也较高，均在10%以上，其他各无机矿物质元素的含量相对较低。

1.2  入血成分及其代谢产物表征和辨识

中药复方制剂口服后，其有效物质首先吸收入血，再通过血液运输到达疾病治疗靶点发挥治疗作用，因此，只有被吸收入血的化学成分或相关代谢物，才有机会在靶器官维持一定的浓度，才有可能被看作是潜在的生物活性成分。本课题组进一步采用血清药物化学方法，运用UPLC-Q/TOF-MS技术，对口服给予海马补肾丸后大鼠血浆中吸收的原型成分及其代谢产物进行辨识研究，通过建立给药血浆的血行指纹谱，比对成品制剂、大鼠给药血浆及空白血浆样品的色谱图，筛选分析血中移行的原型药物成分及代谢物，结果在大鼠血浆中共鉴定得到30个海马补肾丸相关的外源性化合物，包括22个原型药物成分和8个代谢产物，它们可能是复方潜在真正的活性成分。

2  基于“有效性”的质量标志物的发现与确定

2.1  基于整体动物模型药效学的“有效性”研究

“有效性”是质量标志物确定的重要条件。海马补肾丸具有滋阴补肾、强身健脑的功效，用于身体衰弱、气血两亏、肾气不足、面黄肌瘦、心跳气短、腰酸腿疼、健忘虚喘等临床证候。本课题组采用多种动物模型，从补肾填精、调节免疫、抗应激及益智健脑几个方面对海马补肾丸进行药效学评价，并研究其作用机制，为其有效性提供实验依据。

采用氢化可的松致小鼠肾阳虚模型，观察海马补肾丸抗阳虚作用和对勃起功能的影响；采用甲状腺素加利血平致小鼠肾阴虚模型，观察海马补肾丸抗阴虚作用；采用去势雄性大鼠及幼龄雄性大鼠模型，观察海马补肾丸雄性激素样作用^[2]。采用免疫功能低下小鼠模型，观察海马补肾丸免疫增强作用；采用小鼠负重游泳及常压缺氧模型，观察海马补肾丸抗应激作用；采用小鼠记忆获得性障碍及记忆巩固性障碍模型，观察海马补肾丸益智健脑作用^[3]。结果显示，给药10 d，海马补肾丸1.1、2.2 g/kg均明显增加肾阳虚小鼠的自主活动次数，延长低温游泳时间，增加胸腺、脾脏的脏器系数；明显减少肾阴虚小鼠跳台错误次数、延长错误潜伏期，明显提高小鼠痛阈，增加小鼠胸腺、脾脏的脏器指数。给药2周，海马补肾丸0.56、1.12 g/kg均明显增加大鼠基础勃起率/海绵体静息率（bR/rR）值、海绵体内压，明显改善小鼠勃起功能，明显增加去势大鼠血清睾酮（T）浓度及前列腺、包皮腺、提肛肌的脏器指数，明显增加正常幼龄大鼠血清T、卵泡生成素（FSH）浓度及精液囊的脏器指数，明显延长疲劳大鼠游泳时间；海马补肾丸1.1、2.2 g/kg均能明显增强免疫功能低下小鼠的非特异性免疫及体液免疫功能；海马补肾丸2.2 g/kg能明显改善小鼠的记忆获得及记忆巩固障碍。给药5 d，海马补肾丸1.1、2.2 g/kg能明显延长小鼠常压缺氧存活时间。实验结果表明，海马补肾丸具有明显的滋阴补肾、强身健脑作用，与其功能主治基本相符。

2.2  基于系统生物学的“有效性”研究

在整体动物模型药效学研究的基础上，进一步对海马补肾丸进行代谢组学和蛋白组学研究，根据实验结构进行整合分析，从代谢通路和关键蛋白的角度阐释其作用机制。

复制大鼠肾阳虚模型，给予海马补肾丸干预，结果表明海马补肾丸对氢化可的松所致的肾阳虚大鼠有治疗作用，对模型大鼠的一般状态、生理生化指标都有明显的调节和改善作用。进一步采用代谢组学的研究方法，借助UPLC/Q-TOF MS等技术，建立肾阳虚大鼠血清代谢指纹图谱；并结合主成分分析进行模式识别，寻找与肾阳虚相关的潜在生物标志物，探讨肾阳虚相关的内在代谢循环途径和信号通路。通过比较不同分组（正常、模型、治疗）的潜在生物标志物的种类及含量变化，探究海马补肾丸治疗肾阳虚的作用机制，为其临床应用提供实验依据。

采用同位素相对标记与绝对定量（iTRAQ）技术筛选在接受氢化可的松刺激前后以及服用海马补肾丸前后的实验大鼠的下丘脑、垂体、肾上腺组织内的差异表达蛋白水平。这些由iTRAQ筛选出的差异表达蛋白以及针对这些蛋白的生物信息学分析将有助于全面了解肾阳虚的发病机制和海马补肾丸的作用机制。

结果发现，通路大多富集在亚油酸代谢、甘油磷脂代谢、甾类激素生物合成、磷酸肌醇代谢等11条靶标代谢通路。通过分析发现，代谢组学及蛋白组学存在7条共有通路，即甾体激素生物合成（steroid hormone biosynthesis）、甾体生物合成（steroid biosynthesis）、刺激神经组织的配体-受体相互作用（neuroactiveligand-receptor interaction）、亚油酸代谢（linoleic acid metabolism）、半乳糖代谢（galactose metabolism）、脂肪酸代谢（fatty acid metabolism）、不饱和脂肪酸生物合成（biosynthesis of unsaturated fatty acids）通路。据此推测，海马补肾丸通过作用于垂体组织的Cyp21a1、Hsd3b1等蛋白，肾上腺组织的Cyp51a1、Dhcr7等蛋白来调节甾体激素的生物合成通路以及甾体生物合成通路，进而调节17α-hydroxypregnenolone、11β-hydroxyprogesterone、androstenedione、骨化三醇（calcitriol）4个代谢标志物的血清含量，从而调节机体激素水平。有文献报道^[4]，骨化三醇是活化的维生素D，对于慢性肾功能衰竭患者有良好的治疗效果，能够改善炎症状态，提高肾功能，其可能的机制为骨化三醇与肾脏、甲状旁腺等器官直接作用，提高甲状腺对钙的敏感性，促进钙吸收，纠正钙磷代谢紊乱。同时，骨化三醇还可以抑制甲状旁腺细胞，抑制甲状腺激素分泌，从而避免甲状旁腺功能亢进发生。

有研究^[5]表明，内源性大麻素系统在下丘脑-垂体-卵巢轴有广泛的分布，其特异性受体CB1可表达于子宫及输卵管，也可表达于卵巢的皮质和髓质，大麻素花生四烯酸乙醇胺（AEA）和2-花生酰基甘油（2-AG）结合并活化内源性大麻素受体，脂肪酸酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，FAAH）下调内源性大麻素的浓度，对生殖功能发挥重大调控作用。海马补肾丸还可以通过调节刺激神经组织的配体-受体相互作用通路中甘氨酸受体β-亚单位基因（Glrb）蛋白的表达，以及2-花生酰基甘油（2-arachidonylglycerol）代谢标志物的含量，从而刺激中枢神经兴奋，达到治疗目的。

海马补肾丸可通过调节垂体和肾上腺Fads2蛋白的表达来影响亚油酸代谢通路过程中的亚油酸的代谢；通过作用于垂体组织的Pfkm、Akr1b7蛋白来调节半乳糖代谢通路，进而影响其通路过程中的肌醇的含量，从而调节糖、脂等能量代谢。

海马补肾丸可通过调节垂体和肾上腺组织的Fads2、Tecr、Cpt1a、Hacd3、Acsl1、Acadl蛋白来调节脂肪酸代谢通路，进而调节代谢物左旋肉碱（L-carnitine）的水平。左旋肉碱是一种人体必需的营养素^[6]，研究发现，左旋肉碱作为一种抗氧化剂能够增强细胞抗氧化能力，抑制细胞凋亡，从而保护肾小管上皮细胞。毛科稀等^[7]发现在给予左旋肉碱治疗后，老年慢性阻塞性肺疾病患者的免疫功能得到改善。在生殖系统疾病中，左旋肉碱能治疗男子不育症，参与精子能量代谢、稳定精子细胞膜^[8]。

海马补肾丸可通过作用于垂体组织的Fads2、Tecr、Hacd3和肾上腺组织的Fads2，调节不饱和脂肪酸生物合成信号通路，进而调节二十二碳六烯酸（docosa-hexaenoic acid，DHA）、二十二碳五烯酸（docosapentaenoicacid，DPA）、二十二碳四烯酸（adrenic acid）、十八烯酸（oleic acid）、甘油二酯（diacylglycerol）、二十碳二烯酸（eicosadienoic acid）等代谢物的代谢，加快脂肪分解代谢速度，从而增加能量的产生、增强记忆力和免疫力。有研究^[6]表明，DHA是一种高度不饱和脂肪酸，对人体的生长发育具有重要作用，DHA在健脑明目、增强记忆力和免疫力、抗炎、抗癌等方面均有广泛的作用。有文献报道^[9]，补充DHA对中老年改善认知障碍，特别是对阿尔茨海默病（AD）的治疗具有重大意义。

综上所述，氢化可的松诱导肾阳虚大鼠模型下丘脑-垂体-肾上腺组织的蛋白表达以及相关通路调节发生紊乱，而海马补肾丸给药干预后，机体肾阳虚状态有所改善，通过蛋白组学及代谢组学研究结果推测，其治疗机制涉及调节糖、脂、氨基酸代谢等能量代谢过程，中枢神经系统、激素调节、免疫作用以及炎症反应等方面，通过改善机体能量供应，提高中枢神经系统的调节作用，促进激素合成，增强机体免疫力，缓解炎症反应等达到治疗肾阳虚的作用，显示了海马补肾丸的多靶点、多通路的作用特点。

2.3  基于网络药理学的质量标志物的预测

在化学物质组及药效作用机制研究的基础上，进一步采用网络药理学方法，建立海马补肾丸“化合物-靶点蛋白-信号通路-功效”网络，预测质量标志物。

选取海马补肾丸中包括甾体类、生物碱类、皂苷类、萜类、黄酮类、环烯醚萜及其苷类、酚酸类等类型在内的64个代表性化合物，并根据海马补肾丸的主要功效和适应症，选取与激素调节、免疫、炎症、能量代谢以及益智健脑相关的16个核心靶点蛋白，通过TCMSP、CTD、ETCM、Super Target、UNIPROT、STRING 10、DAVID和KEGG等相关数据库，预测分析了海马补肾丸中64个主要成分的作用靶点，借助STRING数据库获取相关通路信息并进行关联分析，从网络药理学角度，阐释海马补肾丸多成分、多靶点、多途径治疗肾阳虚的科学内涵，预测其可能的质量标志物。

实验结果提示，来源于海马、鹿茸、人参、淫羊藿等药材的胆固醇、人参皂苷Rg₁、淫羊藿苷等成分与孕酮受体（PGR）蛋白相互作用，参与孕酮调节的卵母细胞成熟通路（progesterone-mediated oocyte maturation）过程。已有研究表明，胆固醇为人体的肾上腺皮质和性腺所释放的各种激素，如皮质醇、醛固酮、睾丸酮、雌二醇以及维生素D的前体物质^[10]。人参皂苷Rg₁作用于下丘脑，产生激素调节作用，在外周可抑制皮质酮和促肾上腺皮质激素（ACTH）的反应，发挥抑制下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的作用，促进神经发育，调节神经递质、激素和酶的生成与释放，提高人体对周围环境的适应能力及应激能力，提高认知能力及性功能^[11]。淫羊藿苷具有雄激素、雌激素样作用，能提高雄性激素和雌性激素水平，可明显促进性激素分泌，提高性机能，能促进一氧化氮和环磷酸腺苷的生成，导致阴茎海绵体平滑肌松弛，起到改善勃起功能的作用^[12]。

毛蕊异黄酮具有激活肾上腺、释放皮质激素的作用

来源于熟地黄、黄芪、山茱萸、牛膝、甘草等药材的齐墩果酸、甘草酸、槲皮素、毛蕊花糖苷等成分可作用于白细胞介素-6（IL-6）蛋白，参与调节肿瘤坏死因子信号通路（TNF signalingpathway）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、辅助性T细胞17分化（Th17 celldifferentiation）等通路过程。李雅玲等^[16]发现，齐墩果酸可抑制组胺、花生四烯酸酯氧酶（LTB4）等炎症因子的合成和释放，抑制炎症的发生，其抗炎机制可能与垂体-肾上腺皮质系统有关。甘草酸可能通过对花生四烯酸水解所需的磷脂酶A2和脂加氧酶活性的抑制，使前列腺素（PGs）合成释放受阻，同时选择性地抑制补体系统的激活途径而发挥抗炎作用^[17]。孙涓等^[18]研究表明，槲皮素能抑制组胺、白三烯、前列腺素D等炎症介质释放；还能在mRNA水平和蛋白水平抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶-2（COX-2）和C反应蛋白的产生，发挥抗炎作用。毛蕊花糖苷能通过抑制转化生长因子β活化激酶1-氨基端激酶（TAK-1/JNK）信号通路的活性而激活酪氨酸磷酸酶1（SHP-1）信号通路起到抗炎作用^[19]。

来源于覆盆子、菟丝子、茯苓、山药、肉桂等药材的鞣花酸、金丝桃苷、茯苓酸、薯蓣皂苷、桂皮醛等成分可作用于核转录因子κB p65蛋白（RELA）靶点，参与调节B细胞受体信号通路（B cell receptor signalingpathway）、T细胞受体信号通路（T cell receptor signalingpathway）、趋化因子信号通路（chemokinesignaling pathway）、辅助性T细胞1和2分化（Th1 and Th2cell differentiation）、花生四烯酸代谢（Arachidonic acid metabolism）等与免疫、抗炎相关的过程。

来源于牛膝、山药、人参等药材的蜕皮甾酮、薯蓣皂苷、人参皂苷Rb₁、Re等成分作用于蛋白激酶（Akt1）蛋白，参与调节脂肪细胞内脂类分解调控（regulation oflipolysis in adipocytes）、脂肪细胞因子信号通路（adipocytokine signaling pathway）、磷脂酰肌醇3-蛋白激酶B信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、甲状腺激素信号通路（thyroid hormonesignaling pathway）等通路过程。已有研究发现，蜕皮甾酮可增加蛋白激酶B（Akt）磷酸化水平，同时抑制其下游FoxO1蛋白的表达水平，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）表达也有所下降^[20]。有文献报道^[21-22]，人参皂苷Rb₁可通过调节氨基末端激酶（JNK）信号通路改善糖脂代谢异常。姚培培^[23]在研究人参皂苷Re改善脂质代谢的作用机制时发现，人参皂苷Re能显著降低小鼠血清三酰甘油和胆固醇的含量；能显著改善组织脂肪的沉积；调控肝脏、皮下脂肪、内脏脂肪组织中与脂肪酸氧化、脂肪生成代谢相关基因的表达水平，并可能通过激活磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶信号通路（P-AMPK），改善机体脂代谢。

来源于五味子、覆盆子等药材的五味子醇甲、金丝桃苷等成分与乙酰胆碱酯酶（AchE）蛋白相互作用，参与胆碱能的合成（cholinergic synapse）等通路过程。有学者发现，五味子醇甲有神经保护作用，其能增强PC12细胞对谷氨酸的摄取，降低胞外谷氨酸的浓度，并促进6-羟基多巴胺（6-OHDA）PC12细胞摄取谷氨酸^[27]。金丝桃苷可以降低海马活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）含量以及血清促甲肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、ACTH和皮质酮（CORT）水平，同时增加海马超氧化物歧化酶（SOD）活性和糖皮质激素受体的表达^[28]。

来源于淫羊藿、人参、黄芪等药材的人参皂苷Re、毛蕊异黄酮、淫羊藿苷等成分可作用于NOS2靶点。人参皂苷Re可以通过干预AD小鼠体内氨基酸、卵磷脂和鞘脂等代谢途径，改善AD小鼠的学习记忆能力，减少小鼠大脑中的β-淀粉样蛋白（Aβ），引起AD的重要物质沉积，从而发挥对AD的治疗作用^[29]。毛蕊异黄酮可能通过降低脑组织AchE活性来提高D-半乳糖致衰老小鼠的学习记忆能力^[30]。淫羊藿苷能够抑制脂多糖（LPS）诱导的AD炎症模型小鼠海马iNOS和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）基因的表达，改善小鼠的学习记忆能力^[31]。

2.4  基于受体结合实验的质量标志物的预测

选取促性腺激素释放激素受体（GNRHR）、中枢促肾上腺皮质激素释放因子1（CRF1）/促肾上腺皮质激素释放因子受体1（CRHR1）、雌激素受体α（ERα）、磷酸二酯酶5（PDE5）以及AchE为研究载体，通过运用胞内钙离子荧光检测和酶抑制剂检测技术评价海马补肾丸全方及淫羊藿次苷II、淫羊藿苷、毛蕊异黄酮、槲皮素、山柰酚、异甘草素、金丝桃苷、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rc、黄芪甲苷、齐墩果酸、雌二醇、鞣花酸、β-蜕皮甾酮、五味子醇甲、五味子酚、五味子乙素、京尼平苷酸、马钱苷、毛蕊花糖苷、松果菊苷、补骨脂素、次乌头碱等主要单体成分给药后对GNRHR、CRF1/CRHR1、ERα的激动作用及对PDE5和AchE的抑制活性。通过研究可确定海马补肾丸的关键作用靶点，揭示其药效分子机制，并在分子层面阐释其药效物质基础，确定其质量标志物。

结果表明，源于淫羊藿、肉苁蓉、熟地黄、覆盆子药材的淫羊藿次苷II、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、鞣花酸对PDE5A1具有显著抑制作用；从而改善勃起功能障碍，是壮阳作用的主要物质基础；来源于补骨脂药材的补骨脂素对AchE有抑制活性，是改善记忆作用的主要药效物质基础；补骨脂素、毛蕊异黄酮、松果菊苷、人参皂苷Rb₁、五味子乙素、淫羊藿苷、山柰酚、金丝桃苷、异甘草素9个化合物均有植物雌激素样作用，海马补肾丸治疗肾阳虚的机制之一为激活ERα雌激素受体，从而调控促性腺激素的分泌，影响生殖功能，来源于附子药材的马钱苷对CRHR1具有激活作用，上述化合物是治疗阳虚的药效物质基础。

3  结语

海马补肾丸为由36味药组成的中药大复方，并含有多味动物药和矿物药。化学物质组的辨识与表征具有相当大的难度。本课题组从海马补肾丸中共表征辨识出320个化合物，并从血中辨识22个吸收的原型成分和8个代谢产物，明确了化学物质组，为质量标志物的确定奠定了基础。

“有效性”是确定质量标志物的关键要素，复方药物有效性是基于方（药）-证（病）的对应关系，因此，本课题组从全方和多种整体动物模型入手，观察和评价其药效作用；进一步在方法学上，采用“系统-系统”的模式，进行全方的蛋白组学和代谢组学研究；采用“要素-要素”的模式，进行化合物的受体结合实验和酶学检测；并将网络预测与实验验证相结合，层层破茧，确定药效物质基础，提炼和发现质量标志物。虽然“有效性”是确定质量标志物的最重要的条件，但基于应用目的，“可测性”又是必要条件，本课题组后续将针对“特有性”和“可测性”，对海马补肾丸的质量标志物进行深入研究，最终确定质量标志物，并应用于该药质量评价和质量控制体系。

参考文献（略） 

来  源：张铁军，许  浚，韩彦琪，张洪兵，岳  南，刘昌孝. 海马补肾丸质量标志物研究 [J]. 中草药, 2019, 50(19):4603-4613.