WD40是真核生物中普遍存在的一个超基因转录因子家族，它们在结构上包一个或几个高度保守的WD型结构域，也因此被称为WD40重复蛋白（WDR）。最初WD40转录因子被认为是G蛋白β亚基受体，该结构域包括43个氨基酸残基，N末端为甘氨酸-组氨酸二肽（GH）结构，C末端为典型的色氨酸-天冬氨酸二肽结构（WD）[1]，携带该基序的蛋白称为WD40蛋白。通常情况下，WD40域包含40～60个氨基酸，保守基序由精氨酸/谷氨酸-色氨酸/酪氨酸-天冬氨酸/谷氨酸-精氨酸/赖氨酸（D/E-W/Y-D/E-R/K）构成[2]，该域折叠形成β螺旋结构，与DDB1等不同类型蛋白质或DNA相互作用[3]，通过对WD40基因功能域鉴定，发现其广泛参与细胞凋亡、RNA修饰与加工、蛋白降解、信号转导等基础分子过程[4-7]。
WD40转录因子家族成员已陆续在不同植物物种中被鉴定，伴随不同植物基因组数据资源（JGI：https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）的公开，分别有269、225、200、100个WD40转录因子在拟南芥[8]、谷子[9]、水稻[10]、西红柿[11]中被陆续注释或克隆鉴定，其中85个拟南芥WD40基因，78个水稻WD40基因基于植物全基因组数据获得[12]。有关WD40基因研究也趋于多样化：除WD40基因序列组成、蛋白结构域特征、系统进化分析外，基因功能研究方面，已经发现该转录因子与植物生长、次生代谢、逆境响应等生物过程密切相关。在拟南芥中，过表达WD40可抑制植物生长素积累导致分生组织生长限制[13]；Kong等[14]研究者发现TaWD40基因在小麦种子萌发过程中与盐胁迫、干旱胁迫调控紧密相关。到目前为止，WD40基因在植物次生代谢调控方面，发现其与黄酮类化合物的合成密切相关：在欧洲甜樱桃果实中[15]，WD40通过介导PAL、4CL基因的表达参与花青素合成调控；Aguilar等[16]研究者在辣椒中发现WD40能够特异性调节花青素合成过程中CHS、F3’H等基因表达水平；Zhu等[17]在烟草黄酮合成途径中发现WD40转录因子可与R2-R3型MYB转录因子结合，并以复合体结构操控DFR和ANS基因表达。
红花Carthamus tinctorius L. 是药油兼用的重要经济作物，其花瓣含有丰富的黄酮类化合物红花黄色素（saffloryellow，SY），该药用成分在心脑血管疾病治疗方面疗效突出。拟南芥、樱桃、烟草等植物的黄酮类化合物合成调控研究中，均揭示了WD40通过调控关键酶基因的转录水平，进而催化黄酮及类黄酮化合物发生多羟化反应[16-18]。本课题组前期在红花不同组织转录组测序研究中共预测到89个CtWD40候选转录因子[19]，该转录因子家族在红花中数量较多，推测其可能与红花黄酮及类黄酮化合物合成调控相关。本研究参考前期红花花瓣转录组研究结果，以候选WD40基因为参照[19]，在花瓣cDNA文库中成功克隆了1个CtWD40基因，利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）方法分析其在红花不同组织中的表达差异，并分析其与不同花期花瓣中羟基红花黄色素A含量的相关性，以期揭示该基因在SY合成途径中的重要功能。
1 材料与试剂
1.1 材料
1.2 试剂
2 方法
2.1 总RNA提取
将收集红花花瓣等组织液氮内充分研磨，取100 mg植物材料置于无RNA酶的1.5 mL Eppendorf离心管内，使用Invitrogen TRIzol试剂并参照说明书进行总RNA提取。将获得的总RNA用DEPC水溶解，NanoDrop2000测定260 nm下总RNA浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性。
2.2 CtWD40基因的克隆
利用PrimerScript RT reagent kit试剂盒将红花盛花期花瓣组织总RNA逆转录成cDNA。根据红花花瓣转录组数据（SRA数据库登录号047279.2）中WD40候选基因为参照，根据CDS序列设计合成引物序列分别为上游：（5’-ATGCCAAACACG- CTCGTCATAG-3’）和下游：（5’-TCATTCACCGTC- GTCAGATACA-3’），产物长度为1 053 bp。PCR扩增条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，循环35次，最后72 ℃、5 min。将扩增的DNA片段克隆到T-easy载体上，挑选阳性克隆进行测序。
2.3 基因的生物信息学
2.3.1 序列分析 CtWD40基因序列测序后去除载体序列，提交NCBI数据库进行BLASTN和BLASTX比对分析，搜索同源核酸序列及蛋白质序列。使用DNAMAN、Swiss-Model工具进行蛋白结构域及高级结构预测分析。
2.3.2 系统发育分析 根据CtWD40基因克隆测序结果，推测编码氨基酸序列，使用GenBank BLASTX利用Nr数据库进行比对分析，搜索相似度较高的不同物种WD40蛋白序列，利用MEGA 6.0进行氨基酸序列进化分析，使用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统进化树。
2.4 CtWD40在红花不同组织中基因表达分析
为研究CtWD40基因在红花不同组织中的表达模式，以18 S rRNA为内参基因，利用实时荧光定量PCR技术分别检测CtWD40在根、茎、叶片、花蕾期花瓣、初花期花瓣、盛花期花瓣、衰落期花瓣中转录水平差异。按“2.1”项方法提取上述材料总RNA后，使用PrimerScript RT reagent kit试剂盒合成cDNA；使用SYBR Advantage qPCR premix试剂盒对基因进行表达分析鉴定。CtWD40荧光定量PCR基因引物分别为上游：5’-TCGTTTGA- GCCCGGTATTGTTA-3’；下游：5’-TGCAAGAG- AGAGAAGGCCAA-3’。18 S rRNA荧光定量PCR基因引物分别为上游：5’-GAGAAACGGCTACCA- CATCCAA-3’和下游：5’-TCGTTTGAGCCCGGTA- TTGTTA-3’，扩增产物长度为120 bp，生物学重复次数为3次。使用Mx3000荧光定量PCR仪器（罗氏）进行扩增，反应条件如下：使用2步法，95 ℃预变性5 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，循环40次。
2.5 红花不同花期花瓣中HSYA含量测定
2.5.1 色谱条件 使用DiamonsilC18色谱柱（岛津CLASS色谱工作站，日本），甲醇-0.8%磷酸溶液为流动相甲醇-0.8%磷酸水溶液（28∶72）。体积流量800 μL/min。柱温30 ℃，检测波长406nm，进样量20 μL。色谱图见图1。
2.5.2 对照品溶液的制备 称取HSYA对照品10 mg，使用25%甲醇溶解后，定容至50 mL，作为对照品溶液，用于标准曲线的制备。
2.5.3 供试品溶液的制备 红花花瓣烘干后研磨成粉，称取0.06 g样品精密加入25%甲醇50 mL并溶解，密塞后并称定质量。KQ-100型超声波仪器震荡30 min，放冷后25%甲醇补充质量。
2.5.4 标准曲线的绘制 精密吸取HSYA对照品溶液2.5 mL置5 mL量瓶中，定容，逐级稀释，即得－21128，r2＝1.000 0。
2.5.5 精密度试验 取红花黄色素对照品溶液（质量浓度为25 μg/mL）适量，根据“2.5.1”项色谱条
件进样测定6次，记录峰面积，RSD为6.78%，表明仪器精密度良好。
2.5.6 重复性试验 精密称取对照品6份，根据“2.5.2”项方法制备供试品溶液，根据“2.5.1”项色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果表明HSYA平均值为5.82 μg/mL，RSD为5.25%，表明本方法重复性良好。
2.5.7 稳定性试验 供试品溶液室温放置，分别于0、2、4、8、16、32 h，根据“2.5.1”项色谱条件进样测定，记录峰面积，供试品中HSYA峰面积RSD为5.13%，表明供试品溶液室温放置32 h内稳定。
2.5.8 加样回收率试验 精密称取样品粉末0.06 g，加入质量浓度为25 μg/mLHSYA对照品溶液5 mL，再精密加入25%甲醇40 mL，称定质量，超声处理40 min，放冷，称定质量，甲醇补充质量，平行制备6份供试品溶液。根据“2.5.1”项色谱条件进样测定，RSD为5.89%。
3 结果与分析
3.1 CtWD40基因克隆及序列分析
通过PCR方法扩增获得长度为1 053bp的CtWD40基因片段（图2）。测序结果表明获得的cDNA 片段具有1个完整的编码框，可编码350个
3.2 CtWD40基因系统发育分析
氨基酸序列相似性分析在蛋白进化研究中至关重要。为研究红花WD40转录因子的进化关系，利用MEGA6.0软件使用NJ法对红花、山杏、草莓、马铃薯等共19个WD40蛋白序列进行系统发育分析，系统进化树构建结果见图5。研究结果发现，蛋白亲缘关系较近的种属在进化树上距离最近。红花、向日葵、莴笋3个WD40转录因子聚在同一个进化枝上，具有较近亲缘关系。红花、向日葵、莴笋均为菊科植物，红花WD40与莴笋WD40亲缘关系最近。此外，茄科植物烟草、马铃薯、番茄、潘那利番茄WD40转录因子集中分布在另一个进化枝上，说明其亲缘关系较近。
3.3 红花不同组织中CtWD40基因表达分析
基因表达分析结果发现，CtWD40基因在红花不同组织中均存在表达（图6）。在不同花期花瓣中CtWD40基因表达呈现先高后低趋势。CtWD40在花瓣组织中显著高表达，相对花蕾期，初花期及衰落期，CtWD40基因在盛花期花瓣中具有最高表达水平，为花蕾期的5.48倍。在叶片、根、茎组织中CtWD40表达也有一定差异。
3.4 不同花瓣组织中HSYA含量分析
HSYA在不同时间花瓣中含量呈现先升高后降低趋势（图7），盛花期花瓣中质量分数最高，为（47.59±质量分数HSYA
4 讨论
与其他植物WD40蛋白同源比对分析，发现其与向日葵WD40及莴笋WD40蛋白序列相似性最高，亲缘关系最近，且红花、向日葵、莴笋均属菊科植物，该结果说明上述3种菊科植物在进化史上物种分化时间相对最短，符合红花与其他双子叶植物的进化关系，系统发育分析结果也辅助证实了CtWD40转录因子的编码序列扩增正确。
WD40在不同组织中的时空表达特异性推测可能是导致表型差异的原因之一。研究报道指出WD40是植物黄酮及类黄酮化合物合成过程的主要调节因子，WD40不同家族成员不同植物中均存在时空表达差异。棉花纤维发育研究中发现9个WD40转录因子表达水平与棉纤维发育阶段相关[20]；大豆中161个WD40转录因子呈现出不同的组织特异性表达模式[21]；Liu等[22]在对奇异果色素积累的研究中发现多数WD转录因子在不同发育阶段果实中呈组成型表达，但WDR1和WDR2 2个转录因子在绿色果实中特异性高表达。本研究揭示了CtWD40在不同阶段花瓣组织中的表达模式及与HSYA积累水平具有相关性。
CtWD40在盛花期花瓣中表达水平显著升高，暗示该基因在在花期演变过程中可能存在重要的调控作用。植物特异性组织或器官中代谢物积累水平、特定生长周期中信号诱导等因素都会影响植物表型特征改变[23]。本研究中HSYA是红花花瓣中的主要黄酮类物质，也是引起花瓣颜色变化的主要黄酮类化合物。WD40转录因子参与多种植物的黄酮及类黄酮化合物的合成调控，且CtWD40在花瓣中的基因表达趋势与HSYA含量变化趋势具有显著正相关性，暗示了CtWD40基因极有可能参与了红花黄色素合成的分子机制。
本研究克隆并获得了CtWD40基因序列，并对其蛋白结构、保守结构域及系统发育等内容进行了相应研究。在花瓣组织中的表达情况推测该转录因子可能与红花的黄色素合成调控相关。在该基因调控的分子机制调控方面，CtWD40转录因子介导的黄酮合成机制有待深入开展。
参考文献（略）
来 源：董园园，李俊锋，彭鸿远，王一非，王 刚，王丽艳，姚 娜，刘秀明，李海燕. 红花CtWD40基因克隆及表达分析 [J]. 中草药, 2019, 50(15):3660-3666.
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