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我国自1992年在新生儿开展乙肝疫苗普种已来，乙型肝炎病毒（HBV）所致新发感染已有明显减少。但我国目前仍有约9300万慢性HBV感染者，其中慢性乙型肝炎患者2000~3000万，慢性HBV感染所致慢性乙型病毒性肝炎及其相关疾病仍是是我国主要的传染性疾病。近年来，人们对慢性HBV感染的自然史有了更为深入的了解，随着核苷（酸）类似物、长效干扰素等抗病毒药物的临床应用，使得慢性乙型肝炎抗病毒治疗取得了明显发展。慢性HBV感染分期及临床抗病毒治疗相关的病人基线评估、治疗方案选择、疗效评价和预后判定等方面对乙型病毒性肝炎的实验室检测提出了新的要求。我国在乙型病毒性肝炎诊断试剂的研发近年来也取得了较大进步，但与国际一流诊断试剂相比仍有一定的差距。本文着重讨论HBV DNA定量检测在慢性HBV感染分期、临床抗病毒治疗中的应用及意义。并就我国在乙型病毒性肝炎诊断试剂的研发上所面临着较大的挑战进行了讨论。
一、慢性HBV感染
HBV可引起急性或慢性感染。急性感染潜伏期1~4个月不等，是否有临床症状与感染时年龄有关，儿童时期 (小于4岁) 临床型感染的发生率<10%；而成人感染HBV后，临床型感染占30%以上。急性乙型病毒性肝炎的临床症状典型，辅以肝脏生化学检查如血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 异常，或/和血清胆红素升高，血清学检测如HBsAg阳性、抗-HBc IgM阳性，结合病史即可明确诊断，HBV DNA检测在急性乙肝诊断上无太大意义。急性HBV感染超过6个月或血清HBsAg、HBV DNA检测持续阳性超过6个月即可诊断为慢性HBV感染。
通过病原学、血清学、生化学、肝脏组织学检测，结合感染史及临床资料，可将慢性HBV感染分为4个阶段：免疫耐受期、免疫清除期、非活动性乙肝表面抗原（HBsAg）携带状态和再活动期。免疫耐受期 围产期及幼儿期暴露所致HBV感染多有典型的免疫耐受期，而青少年及成人期暴露所致感染多无此期。尽管有较高病毒复制，但由于HBV并直接致细胞病变作用较弱，处于免疫耐受期者可持续数十年而无明显肝脏疾病进展。免疫清除期 是宿主免疫系统通过攻击感染HBV的肝细胞试图清除感染的过程，包括T细胞分泌的非细胞毒性细胞因子的细胞内活性，以及特异性细胞毒T淋巴细胞 (Cytotoxiclymphocyte，CTL) 对感染肝细胞的溶解杀伤等。肝脏坏死性炎症反应是此期的主要特征，可表现为ALT持续升高，也可有间歇升高。免疫清除期的持续时间及炎症强度与患者将来发生肝硬化或肝癌的危险性密切相关。非活动性HBsAg携带状态 随着机体针对HBV感染的免疫反应，约有66%或更多的感染者会发生HBeAg血清转换， ALT在正常范围内，肝活检无明显的炎症反应，但HBsAg持续阳性。非活动性HBsAg携带状态是最为常见的慢性HBV感染状态，我国大多数慢性HBV感染者属非活动性HBsAg携带者。感染者可长期处于非活动性HBsAg携带状态，当机体免疫力低下时或其它原因，非活动性HBsAg携带者可进入再活动期。无论是围生 (产) 期和婴幼儿时期，或是在青少年和成人期感染HBV者，在其非活动或低 (非) 复制期的HBV感染者中，都可有部分患者发生再活动。再活动期处于再活动期者肝脏有活动性炎症反应，实验室检测ALT间歇升高、血清HBsAg持续阳性，临床上多为HBeAg阴性慢性乙型肝炎，也有少数可出现HBeAg阳转；或发生前C或C区启动子变异，HBV再度活动，但HBeAg阴性，两者均表现为活动性慢性乙型肝炎。值得注意的是部分HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者不经非活动性HBsAg携带状态而直接转为HBeAg阴性慢性乙型肝炎。乙肝恢复期 每年约1%非活动性HBsAg携带者可自发性清除HBsAg，实验室检测血清HBsAg阴性，可有抗-HBc和抗-HBs抗体阳性，血清中检测不到HBV DNA，称为乙肝恢复（Resolved Hepatitis B），由于我国慢性HBV感染者多在婴幼儿时期感染，自然发生乙肝恢复者较为少见。隐匿性HBV感染 (Occult HBV infection) 血清HBsAg检测阴性，但外周血或肝组织中可检测到HBV DNA。应注意隐匿性乙型病毒性肝炎的实验室诊断。
二、HBV DNA实验室定量检测的意义
乙肝病毒在宿主肝细胞内持续复制是HBV慢性感染的主要决定因素，HBV共价闭合环状DNA (HBV cccDNA) 是病毒复制过程中的一种中间形式，每个感染肝细胞平均有5~50拷贝，半寿期为14.5年。HBV cccDNA既能转录产生3.5kb前基因组mRNA，又能转录出病毒mRNA并翻译产生包括HBsAg在内的病毒蛋白，是乙肝病毒复制水平最特异的指标，但通过肝活检来监测患者肝组织中的HBV cccDNA水平在临床应用上有一定的难度。血清HBV DNA 水平与传染性和疾病进展密切相关，是病毒复制活动最直接和最可靠的标志，是目前评价HBV 复制情况的“金标准”， HBV DNA检测是唯一能帮助确诊隐匿性HBV感染和隐匿性慢性乙型肝炎的实验室检测指标。而HBV DNA定量检测对血清学非典型的慢性HBV感染者诊断至关重要，对非活动性HBsAg携带状态的判定 (血清HBV DNA<2 000IU/ml) 有重要意义，也是了解HBeAg阴性慢性乙型肝炎病毒复制水平主要指标。
慢性感染各个时期具有明显不同的病毒学特征和宿主免疫反应状态和肝脏病理损伤。HBV DNA实验室定量检测有助于确定感染者的状态，对确定是否开展抗病毒治疗及适宜抗病毒治疗方案的选择至关重要。
免疫耐受期 其主要特征是病毒复制活跃，实验室检测感染者外周血有较高载量的HBV DNA，通常高于20,000 IU /mL(1x10^5拷贝/ml,下同)，血清学检测表现为HBsAg和HBeAg阳性，感染者的ALT多正常或仅有轻微升高，肝脏组织病理学正常或仅有轻度炎症反应。
免疫清除期 实验室检测为HBsAg持续阳性，ALT持续升高，也可有间歇升高。外周血HBV DNA持续维持在较高水平，通常高于20,000 IU /mL，或有波动。处于此期的慢性HBV感染者HBeAg多为阳性，HBeAg阳性表明有较高的病毒复制，传染性较强，可诊断为HBeAg阳性慢性乙型肝炎。非活动性HBsAg携带状态 约有66%或更多的感染者会发生HBeAg血清转换，实验室检测HBsAg持续阳性，但HBeAg消失，抗-HBe阳性，病毒维持低水平复制，外周血病毒载量低于2,000 IU /mL或检测不到，ALT在正常范围内，肝活检无明显的炎症反应。再活动期 实验室检测ALT间歇升高、肝脏有活动性炎症反应，血清HBsAg持续阳性，可有抗-HBe阳性，或HBeAg阳性。外周血病毒载量可低于2,000 IU/mL。但如发生pre-C/C区突变，HBeAg表达下调或不表达，此时尽管HBeAg阴性，HBV仍处于高复制状态，外周血仍可检测到较高的病毒载量。
乙肝恢复期 每年约1%非活动性HBsAg携带者可自发性清除HBsAg，实验室检测血清HBsAg阴性，可有抗-HBc和抗-HBs抗体阳性，血清中检测不到HBV DNA，称为乙肝恢复（Resolved Hepatitis B），由于我国慢性HBV感染者多在婴幼儿时期感染，自然发生乙肝恢复者较为少见。
隐匿性HBV感染 (Occult HBV infection)血清HBsAg检测阴性，但外周血或肝组织中可检测到HBV DNA。
表1为帮助确定不同感染阶段的实验室检测指标及意义。
慢性乙型肝炎、代偿期和失代偿期肝硬化的5年病死率分别为0%~2%、14%~20%和70%~86%，慢性乙型肝炎所致相关肝脏疾病是HBV感染的主要致死原因，我国每年因HBV感染导致的肝硬化、肝癌死亡达30余万例。因此，对慢性乙型肝炎应积极进行干预治疗。慢性乙型肝炎的总体治疗目标是：最大限度地长期抑制或消除HBV，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延缓和阻止疾病进展，减少和防止肝脏失代偿、肝硬化、HCC及其并发症的发生，从而降低病死率，改善生活质量。慢性乙型肝炎治疗主要包括抗病毒、免疫调节、抗炎保肝、抗纤维化和对症治疗，以抗病毒治疗最为关键。抗病毒治疗主要通过长期抑制HBV复制来实现上述目标。抗病毒治疗主要用于免疫清除期和再活动期的活动性慢性乙型肝炎患者。因此，首先需要通过HBV DNA的定量检测等可靠的实验室诊断来确定慢性乙型肝炎适宜治疗患者及治疗时机，并据此确定合适的治疗方案。此外，治疗过程中通过HBV DNA的定量检测监测病毒学应答对于判定抗病毒疗效、调整临床抗病毒治疗方案及预后等有重要意义。
目前的治疗乙型肝炎的药物主要是包括两类：一类为普通干扰素α和聚乙二醇干扰素α，另一类为核苷（酸）类似物。干扰素具有增强免疫和抗病毒作用，通过一定疗程可使部分患者获得较为持久的应答，有研究报道接受长效干扰素治疗患者中HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者的HBsAg清除率可达到3%~10%。患者HBsAg消失或血清转换的比率高于核苷（酸）类似物，但干扰素类药物治疗存在不良反应，限制了其在临床的广泛应用。核苷（酸）类似物通过抑制逆转录过程，以抑制病毒复制，抑制病毒作用较强，但短期内不能清除肝细胞内HBV cccDNA，停药后复发率高。一直认为，核苷(酸) 类似物治疗慢性乙型肝炎，HBsAg清除率较低，难以作为治疗终点指标，但近年来，随着临床抗病毒治疗方案的不断优化和完善，通过持续的核苷 (酸)类似物抗病毒治疗，慢性乙型肝炎HBsAg清除率有所提高，部分报道可达6%。
HBV DNA的定量检测除用于慢性乙型肝炎的诊断外，患者外周血中HBV DNA载量也是决定是否进行抗病毒治疗的重要指标，几乎各国慢性乙型肝炎防治指南均推荐依据病毒载量确定是否开始抗病毒治疗。血清HBV DNA定量是确定患者抗病毒治疗适应证的重要指标，对于HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，HBV DNA ≥20 000 IU/mL，且有肝脏活动性炎症者 (ALT升高，或肝活检发现肝脏炎症指数≥G2)，即应开展抗病毒治疗。HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者往往病史较长，病变长期积累，肝硬化年发生率达8%~10%，高于HBeAg阳性慢性乙型肝炎(2%~5%)，因此，更应积极开展对HBeAg阴性慢性乙型肝炎的治疗，当HBVDNA ≥2 000 IU/mL伴有肝脏活动性炎症指标时，即应开始抗病毒治疗。
血清HBV DNA水平的下降为判定抗病毒治疗效果的重要依据，是基于应答指导的治疗 (response-guided therapy) 的重要指标。因此，治疗前应有基线水平检测，一旦开始治疗，则应每3~6个月检测一次，动态监测HBV DNA水平的变化，同时检测ALT、HBeAg和抗-HBe。核苷（酸）类似物治疗线路图（roadmap）主要依赖HBV DNA的定量检测确定病毒学应答情况，对判断疗效、预后和耐药发生至关重要，是对治疗方案进行优化和调整的重要依据。如果HBV DNA水平在核苷（酸）类似物治疗有效，同一药物继续治疗；否则为治疗失败应进行联合治疗。其中治疗24周时的血清HBV DNA绝对水平若低于60 IU/mL为完全病毒应答，可继续同一药物治疗；高于60 IU/mL但低于2 000 IU/mL为部分应答，应根据选用的具体药物确定是否调整。治疗24周时患者血清HBV DNA水平高于2 000 IU/mL则为应答不充分。
三、我国乙型病毒性肝炎诊断试剂的研发
良好的诊断试剂是通过可靠的实验室检测来准确诊断慢性乙型肝炎、开展有效抗病毒治疗的前提，这对开展流行病学调查，准确掌握我国HBV感染的流行情况并制定相应的防控措施同样至关重要。基于我国乙型病毒性肝炎诊断试剂的现况及发展需求，我国在中长期科技发展规划“传染病防治重大专项”病毒性肝炎领域设置了专门的研究课题，以加强我国乙型肝炎诊断试剂的研发实力，提高国产诊断试剂质量，研发新的定性和定量检测试剂，满足乙型病毒性肝炎的诊、防、治需求。在“十一五”期间重点开展了现有的乙型/丙型病毒性肝炎酶联免疫试剂盒和核酸定量检测试剂盒在特异性、稳定性和灵敏度方面的改善，通过优化现有纯化系统及生产工艺，规范生产流程，强化质量控制体系，提高现有的乙型/丙型病毒性肝炎酶联免疫试剂盒和核酸定定量检测试剂盒的特异性和灵敏度；利用基于发光技术等高灵敏标记技术和检测体系，研发灵敏度和特异度更高的定性、定量免疫诊断试剂盒，开展了相应溯源标准物质的研制；依据我国病毒性肝炎流行病学调查结果，开发乙型肝炎病毒基因分型和耐药变异的检测试剂盒。近期对这些研发试剂盒的考评显示，酶联免疫检测试剂的质量已有较大提高，定量检测试剂的线性范围、检测下限等已有较大改善。但应看到，在病毒性肝炎实验室诊断方面，国际上单一诊断试剂的概念已逐渐被全自动、系统化的诊断技术所取代。我国在检测试剂的全自动系统化方面与国外有较大差距，影响了诊断试剂质量的进一步提高。此外，随着临床抗病毒治疗和新兴免疫治疗技术方法的开展，在适宜治疗病人筛选、治疗效果评价和预后判定等方面对病毒性肝炎实验室检测和诊断技术提出了新的需求。因此，在今后的工作中，应加强源头研发，大力推进拥有自主知识产权的高质量的抗原、抗体等关键原材料研制；利用“十一五”的抗病毒治疗、自然史转归研究等项目的成果，研究能预测病毒性肝炎慢性化、重症化转归相关的生物标志物，开展临床研究评价；研发基于新型标记技术、体系的全自动检测系统的研制，通过对现行免疫学筛检方法风险残余度分析及输血感染乙型/丙型肝炎数据分析，研究适合于血站和血浆蛋白制品生产企业的高通量全自动肝炎病毒核酸检测体系。
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