如果说DNA是上帝造人的图纸，那么以CRISPR为代表的基因编辑技术就是上帝的手术刀。不过这把手术刀的也不是百分百精准，这也成为基因编辑技术临床应用的一大障碍。
一直以来科学家都在追求更好、更实用的基因编辑方法，单碱基编辑是其中一个。但正如这个名字所说的，单碱基编辑只能编辑一个碱基，而且4个碱基总共12种变化中，能实现的只有4种，嘌呤和嘧啶间相互转换的8种统统做不到。
不过基因编辑的这些问题，最近被一位华人科学家改进了一大步。博德研究所的刘如谦将CRISPR与逆转录结合在一起，实现了所用碱基间的自由转换，编辑脱靶和插入缺失的问题也有了很大的改善。这一研究发表在Nature上[1]。
（来自sciencemag.org）
CRISPR这个名字，最初指的是大肠杆菌里一种奇怪的重复基因序列。直到2010年人们才搞清了它的作用，这些序列实际是细菌储存的病毒DNA片段。它转录出的向导RNA与切割DNA的Cas蛋白结合，把Cas蛋白带到入侵的病毒DNA上，切断病毒的DNA，是细菌的免疫系统。
向导RNA+Cas蛋白这样的组合，只要改改向导RNA的序列就可以把Cas带到不同的位置，这不就是基因编辑的绝好工具吗？确实，CRISPR迅速成为了一个大热的基因编辑工具，操作十分简单，甚至生物爱好者自己在家都能完成。
不过CRISPR用来基因编辑却也并不完美。近年来有研究指出，CRISPR基因编辑有可能会激活p53系统，因此最终成功编辑的可能是那些p53功能缺陷的潜在癌细胞！
而且常用的CRISPR/Cas9系统，对于向导RNA的匹配要求并不十分严格，Cas9也有可能不遵守RNA的指引胡乱切割，造成编辑的脱靶，甚至编辑位点远端的大段丢失。
图源：pixabay.com
至于单碱基编辑，那是把Cas蛋白的DNA切割功能去掉，接上个嘧啶脱氨酶等等直接改变碱基的酶，C↔T互变、A↔G互变，都可以在不切断DNA链的情况下进行。但对于C/T↔A/G这样嘌呤和嘧啶间的转化就无能为力了。
而且，单碱基编辑器存在一个编辑窗口，要是窗口里有好几个可以编辑的碱基，编辑的选择性就很差了，也存在脱靶的问题。此外，如果是想插入或删除几个碱基，目前还没有能避免双链断裂的方法去实现。
不过这些问题都被刘如谦解决了。他一方面对Cas蛋白进行了修改，让其只能切断DNA双链中的一条链。另一方面，他还在向导RNA上接上了一段要添加的DNA的模板RNA，成为编辑扩展向导RNA（pegRNA），相应的在Cas上加上了一个逆转录酶，利用模板RNA逆转录出来的DNA去修复目标位点。
PE编辑技术的基本原理
（图源：Susanna Hamilton, Broad Institute）
这一套基因编辑系统被命名为PE。而且在改进的过程中，诞生了PE1、PE2和PE3，三代编辑工具。其中PE1和PE2只能切开一条DNA链，PE3在PE2的基础上加了一份sgRNA，可以切断非编辑链，提高了编辑效率。至于效果怎么样，还得看试验数据说话。
PE3编辑技术的示意图
研究人员首先测试了PE的单碱基编辑能力。相比于传统的嘧啶编辑器，PE对于编辑窗中心的碱基的编辑效果较差，编辑效率不到其一半。不过对于编辑窗边缘的碱基，PE3的效率是传统方法的2.7倍，意外的插入和缺失也较少。而且PE不会影响编辑窗内的其它同种碱基，编辑的精确性更高。
PE与嘌呤编辑器的比较也得出了类似的结果。
对于CRISPR的脱靶问题，理论上，PE的编辑中总共要有三次碱基互补配对：先是pegRNA中向导序列和靶DNA配对定位，然后靶DNA和pegRNA中的引物序列配对开始逆转录，最后逆转录形成的DNA和靶DNA配对完成编辑，应当能很好的避免脱靶。
事实也果真如此。在对携带16个已知的CRISPR脱靶位点的4个基因编辑靶外的测试中，PE对两个靶点编辑的脱靶率都低于0.1%，脱靶率最高也不过2.2%。相比之下，CRISPR+Cas9的基因编辑，脱靶率在4.3%~60%不等。
PE编辑的脱靶率很低
接下来，研究人员尝试利用PE去修复了几种常见的单基因遗传病。
镰状红细胞贫血是血红蛋白基因中一个A·T→T·A转位引起的，导致β球蛋白中的E6V突变。这样的转位，通过单碱基编辑是无法修复的。而使用PE对其进行编辑修复的有效率可以达到58%，只有1.4%出现了意外的插入或缺失。
Tay-Sachs病是一种常染色体隐性遗传病，患儿常常在6个月内出现大脑发育紊乱，在3岁左右死亡。它是由HEXA基因中一个4碱基的插入引起的，PE对这一基因异常的修复也达到了33%的有效率，插入和缺失只有0.32%。
相比于传统的CRISPR/Cas9切割+同源重组修复，PE的编辑/插入缺失比例大约高出了270倍，编辑的准确性大大提高。而且由于PE的适用范围十分广泛，研究人员估计，大约89%的人类遗传病基因突变，都有可能可以通过PE纠正。
目前，这一基因编辑技术已经授权给了Prime Medicine公司进行开发，希望这一技术能够早日得到应用，最好还能便宜些。
参考文献：
1. ANZALONE A V, RANDOLPH P B, DAVIS J R, et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA[J]. Nature, 2019.
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