随着生物医学技术的进步，我们对于先天性心脏病（Congenital Heart Disease, CHD, 先心病，此后简称为“先心病”）的遗传学认知在不断提高，但仍有很多未解之处，尤其是以散发形式出现的疾病。大规模平行测序技术（Massively Parllel Sequencing, MPS）从疾病诊断和致病机制研究的角度为此领域的发展做出了突出贡献。得益于此技术，散发样本中新发突变的致病性不断被发现，心血管和神经系统发育之间的相关性被确立，随后又发现了导致散发/家系样本中潜在遗传变异的证据。纵然目前大部分先心病的致病原因仍不清楚，但近期对于不同类型遗传变异及其不同病因学机理的发现，对我们认识家族性/散发先心病具有里程碑式意义。
继19世纪50年代首次发现先心病的遗传性以来，很多研究者都致力于揭示其遗传属性。包括60年代 James Nora等科学家进行的多因素遗传研究，具有划时代意义的Baltimore-Washington 婴幼儿研究（图1）。早期的先心病家系研究运用连锁分析、候选基因研究等方法，为揭示结构性心脏病的遗传背景起到了重要作用。许多重要基因如NKX2-5,GATA4, TBX5, NOTCH1, 和TBX20等均在此时期被发现。但先心病家系的罕见性使得大家系连锁分析常用的孟德尔共分离定律在实际运用中十分受限。
2000年初兴起的染色体微阵列分析（Chromosomal Microarray, CMA）技术为本领域的研究提供了新的工具（图1）。运用此方法，TAB2基因上一段850KB的缺失首次在12位先心病患者中被发现。随后又陆续发现了与内脏异位，法洛氏四联征，左位心等多种先天性心脏缺陷相关的基因。虽然CMA有很多重要用途，但在临床诊断中的应用，尤其是在排除21三体综合征、22q11微缺失综合征等疾病时仍非常受限。继Reamon-Buettner与Borlak 和Leipzig 心脏招募研究之后，体细胞突变一度被认为是导致先心病的重要机制，但此后根据此假设进行的研究却发现甚少，提示体细胞突变在先心病的发生过程中可能并不起主要作用。后来又有研究表明其它致病机制如突变型转录因子脱靶参与了模式动物中先心病的发生。
图1 先心病遗传发现、遗传学技术及所用研究方案发展时间轴
此后，研究者开始意识到应用连锁分析和CMA的方法发现的遗传变异大多具有家族特异性，不能反映大多数散发型先心病的情况；从而提出了“常见疾病-常见变异（Common Disease–Common Variant）”的假说，认为先心病可由多个具有微量效应的常见突变所导致。此理论的提出与我们对复杂性先心病的认知相符，于是开启了全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies, GWAS）的时代，研究常见单核苷酸多态性位点（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）与先心病的关系，发现了许多相关位点。但遗憾的是，GWAS的应用已有十多年，迄今为止仍无法判断出具体哪些SNP具有真正的致病作用。在分析中具有显著相关性的位点，临床相关性却不高；很多GWAS的发现也不适用于另一种族，只能解释少部分人的发病风险。总之，GWAS不能确定复杂性先心病的主要遗传变异，GWAS所发现位点的作用被归结为“遗传力丢失（Missing Heritability）”。在遗传力丢失理论的基础上，还有人提出了“在常见变异和环境因素的基础上，罕见变异能发挥极大效应”的理论。
MPS技术，也称为二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术，的发展为解释遗传力丢失提供了有力工具。MPS既可以是靶向测序（如全外显子组测序、基因组合测序），又可以是非靶向的全基因组测序。得益于MPS偏向性小的技术特点，基因组常见/罕见变异，碱基插入/缺失，拷贝数变异等信息都能被挖掘出来；从另一角度讲，分析特定个体的遗传变异，也便于追踪患者的家系情况。把大规模的表型、种族相似的散发人群研究转移到表型明确的家系研究，更适合临床应用。全外显子组测序在散发样本中应用也取得了重要进展（表1）。当只保留无义突变，剪接突变，移码突变时显著提高了基因变异与疾病的相关度，这些研究也提示了神经系统发育异常与非综合征型先心病之间存在基因层面上的关联性。值得注意的是，综合征型先心病病例中,新发生的蛋白截短突变较多，而非综合征型先心病病例中，遗传性的蛋白截短突变更多。当然，在实际应用中二代测序技术也遇到了很多瓶颈，变异位点的致病性解读尤其具有挑战性。其它MPS技术，例如靶向基因组合检测也已被应用到先心病中。先心病特异性基因组合检测在家族性非综合征型先心病患者中致病基因检出率可达31%。基因组合检测的目标性和特异性强，与其高覆盖率，低数据存储需求相应的是难以挖掘新致病基因的代价。现如今，随着WES和WGS测序成本的降低，这类更全面的测序技术正在被加速推广。总而言之，这些研究展示了MPS技术在先心病中的成功应用，更多的未解之迷的答案可能不在全外显子组或全基因组信息中，而在基因组学之外，例如非编码的调控组（Regulome）。在以家系形式发生的先心病中，尤其是小家系中，很有可能是在1个或多个突变位点的基础上与其它突变共同作用导致表型显现的。迄今为止，还没有用WGS技术进行先心病研究的文章发表，要想弄清其中的遗传结构，将需要更为复杂的分析策略。
表1 在散发先心病中应用MPS研究的发现总结
在先心病中应用MPS技术，除受试者本身获益之外，也为我们理解先心病的遗传构架做出了重要贡献。首先，不是所有看起来是孟德尔遗传形式的先心病都是由单基因导致，也有可能是2个或多个基因所致。其次，在最近的一些研究中，一个新颖的、共同的主题是关于先心病发病遗传变异负担。外显率低及表型差异大使得孟德尔遗传与复杂疾病之间的界限越来越模糊。另外，这些研究发现新发变异在散发先心病产生的作用占10%左右。最后，这些研究提示了心-脑发育之间的遗传关联，当然并不是所有的先心病都有神经发育缺陷，反之亦然。
Zaidi等人提出了先心病基因负荷的第一个证据。在对散发先心病的研究中，他们发现了H3L4甲基化过程中涉及到的基因有大量新发突变。随后，在心脏特异性表达基因及全部基因中都发现了大量的破坏性的新发变异。这些研究的结果表明，新发突变和遗传性罕见变异组合成为疾病的致病原因。有研究发现在综合征型的患者中，与无心脏缺陷表型的患者相比有心脏缺陷表型的患者的额外基因负荷增多；在家系研究中也发现了额外基因负荷的现象，家族性先心病样本中罕见突变和低频突变（MAF<>
在合并神经发育障碍（Neurodevelopmental Disabilities，NDD）或先天心外畸形（Extracardiac Congenital Anomaly，ECA）的先心病病例中研究发现，病例组破坏性新发变异基因比对照组高3倍，心脏特异性表达基因比对照组高4.7倍。在其它神经性疾病研究中发现的很多额外负荷基因在心脏中高表达，提示这些新发突变具有多效性，会影响心、脑和其它器官的发育。因此，额外基因负荷可能在先天性疾病中普遍存在，其中涉及的复杂发育过程及相互作用需要进一步研究。
理解先心病的遗传背景对于患者本人和其家庭规划以及临床管理都具有重要意义。大多数先心病患儿都能存活至成年，研究重点也就转向了改善患者的术后结局，管理及生活质量。已有研究关注到了与高效手术方案及技术相关的问题，但对远期结局的认识还很匮乏。与术后结局相关的典型研究包括：氨甲酰-磷酸合成酶I型基因型与术后肺动脉压力增加相关；血管紧张素转换酶插入/缺失多态性与术后心动过速事件增加有关；线粒体醛脱氢酶2基因型，与对缺血和再灌注损伤的耐受力有关。其它类型的变异如CNV也与重要临床事件相关。最近, Kim等人发现先心病儿童中存在拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV），其手术后增加死亡或移植的风险增加2.55倍； 同一小组的早期研究发现，外科手术后的婴儿若在VEGFA和SOD2基因 SNPs： rs833069 和rs2758331上有纯合突变，其死亡或心脏移植的风险增加了16倍。总的来说，这些研究表明，CNVs以及特定的基因型是术后存活及发生心脏移植的重要因素。
鉴定特定基因型或等位基因与长期外科疗效相关是一个不断发展的研究领域，更不用说在直接与临床管理相关方面的研究了。基于MPS识别罕见和常见变异的能力，很可能会发现基因型和远期结局之间的更多关联，从而可提供个性化治疗及选择最佳治疗方案。
综合从连锁分析、GWAS及最近的MPS研究成果，我们对先心病的致病因素有了更清楚的认识，虽然我们不能为每一位患者找到其致病原因，对了解不同变异类型及其作用有了更深入的了解。
图二. 先心病遗传学图解: 不同形式的非综合征先心病患者中已知和未知原因的百分比
目前已有约400个基因被发现与先心病相关。一些之前未发现的罕见变异或心脏外表现如NDD相关变异也可能与先心病相关。MPS技术为之做出了重要贡献。虽然WGS的应用正在起步阶段，用此方法极有可能找到先心病在非编码区的致病位点，包括调控元件和miRNA。
而介于遗传背景于环境因素之间的表观修饰因子，如在胚胎发育时期供氧不足也有可能是先心病致病的重要因素。目前来看，先心病致病机制研究最大的瓶颈在于是否能充分解每个特定个体的各类因素、其产生的影响，以及它们是如何致使特定个体发病的。
将这些信息转化到临床工作和病人护理中还需要进一步提升和改进。对于一个孤立的、散发的先心病的个体来说，目前的基因检测检出率很低，但在未来几年内有望取得重大进展。但是，现阶段已经可以为更多的家族性和综合征型先心病患者提供遗传诊断。我们现在也有一个统一的假设可以解释很多儿童的NDD合并先心病的情况，也进一步说明和确立了遗传学在先心病中的作用不仅仅是一项科学研究工作也是揭示临床困惑的重要过程。
病人管理方面：随着遗传解析能力的提高，在非综合征型家族性先心病，先心病合并其他先天性心外畸形患者中进行分子诊断时，诊断率高，值得一试。明确的遗传学诊断结果对于患者管理和家庭计划具有重要意义。
转化前景：遗传学及分子检测正在被更多的患者接受，尤其是那些症状明确，附带其它出生缺陷或发育迟缓的患者。确定复杂的，散发形式的潜在遗传负荷是下一步的发展方向。
参考文献：Blue, G. M., et al. 'Advances in the Genetics of Congenital Heart Disease: A Clinician's Guide.' Journal of the American College of Cardiology 69.7(2017):859.
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