评价者：刘晓晴1
文献合成者：黄淑梅2
1. 解放军第307医院肺部肿瘤科，北京 100071；
2. 广东省人民医院肿瘤中心、广东省医学科学院、广东省肺癌研究所，广州510080
1.文献来源
Azuma K, Ota K, Kawahara A, et al.Association of PD-L1 overexpression with activating EGFR mutations insurgically resected non small-cell lung cancer[J]. Ann Oncol, 2014, 25(10): 1935-1940.
2.证据水平
3a。
3.背景
PD-1主要表达于T细胞表面，可以调节T细胞的活性及增殖。PD-1的配体PD-L1表达于多种肿瘤细胞上。PD-L1与PD-1结合可诱导活化的T细胞凋亡或者疲劳。
临床研究表明阻断PD-L1与PD-1的相互作用，可以增强T细胞的抗肿瘤活性。
非小细胞肺癌（non-smallcell lung cancer, NSCLC）中PD-L1的表达水平与临床预后的相关性，目前仍不清楚。
4.目的
通过IHC检测NSCLCPD-L1 的表达情况，PNA LNA PCR-Clamp法检测EGFR基因突变状态，阐述PD-L1表达与EGFR信号通路的关系，回顾性分析多个临床病理特征与NSCLC预后的相关性。
5.研究设计
研究条件：由MEXTKAKENHI资助（基金号码24501359）
研究时间：2000-2010年。
研究方法：回顾性临床研究。
研究对象：2000-2010年期间在久留米大学医院接受手术患者的肿瘤标本及NSCLC细胞系。研究获得久留米大学医院伦理委员会批准。
干预措施：研究共纳入164例NSCLC患者，采用IHC方法检测细胞PD-L1表达情况（积分法，高于30分为高表达），采用PNA LNA PCR-Clamp（peptide nucleicacid–locked nucleic acid polymerase chain reaction clamp）法检测肿瘤EGFR基因突变状态，免疫印迹法检测NSCLC细胞系EGFR磷酸化水平，流式细胞技术检测NSCLC细胞系PD-L1表达水平，分析PD-L1表达与EGFR磷酸化之间的关系。
评价指标：EGFR基因突变状态、PD-L1表达水平、EGFR磷酸化水平、生存期。
6.主要结果
NSCLC中，PD-L1表达增高与女性、不吸烟者、腺癌和EGFR突变患者显著相关。见图1。EGFR 基因突变（突变型vs.野生型，比值比25.4，95%可信区间2.9~47.9，P=0.027）及腺癌（腺癌vs.鳞癌，比值比25.1，95%可信区间0.5~49.8，P=0.046）是PD-L1高表达的独立因素。
图1 肿瘤标本PD-L1免疫组化染色与其临床特征的相关性分析
EGFR突变的NSCLC中，通过EGFR信号通路上调PD-L1的表达。见图2。
在EGFR敏感突变同时伴有T790M突变的EGFR-TKI获得性耐药细胞系中，持续厄罗替尼治疗并不能降低PD-L1 持续的高水平表达。
生存分析结果提示PD-L1高表达[高表达（高于30分）vs.低表达（低于30分），风险比1.602，95%可信区间1.078~2.380，P=0.020]及肿瘤分期为Ⅱ期或者Ⅲ期(Ⅰ期vs.Ⅱ期或者Ⅲ期，风险比0.463，95%可信区间0.309~0.695，P<>
7.结论
经手术切除的NSCLC，PD-L1的高表达与EGFR基因突变相关，PD-L1高表达是预后的独立危险因素。
8.评论
近年随着针对免疫检测点CTLA-4和PD-1/PD-L1抑制剂在肿瘤治疗中的应用，学者们围绕PD-L1进行了诸多探索性研究，虽然结果不尽如意但却亦有称道之处，此为理想中的个体化或精准免疫治疗奠定了基础，并提供了有益启示。
2014年发表于Annals of Oncology的该项研究，是较早在NSCLC中进行PD-L1表达与预后和EGFR突变关系进行分析的研究之一。研究者采用免疫组化法分析了手术切除的非小细胞肺癌164例标本中PD-L1表达情况，同时用流式细胞术对NSCLC细胞系中PD-L1细胞表面表达进行定量。结果显示，肿瘤标本中PD-L1表达在女性、不吸烟和腺癌患者中较高。多因素分析发现，EGFR突变以及腺癌与较高的PD-L1表达显著相关。NSCLC细胞系中，EGFR基因突变细胞表面PD-L1表达明显高于EGFR野生型。EGFR抑制剂厄洛替尼能下调EGFR基因突变NSCLC细胞系的PD-L1表达；而对于野生型NSCLC细胞系，厄洛替尼无此作用，这提示PD-L1表达增加是通过EGFR信号通路，而EGFR信号通路则是由激活EGFR基因突变所介导。另外对于NSCLC患者，手术切除肿瘤组织中PD-L1表达水平较高者其总生存期明显缩短。
回览近年相关系列研究并与之比较，该项研究亮点如下：
（1）作为单中心研究纳入标本数较多，PD-L1检测采用了半定量免疫组化法。
（2）同时针对NSCLC患者标本和细胞系进行了研究，临床结果与之同时在细胞系研究中给出合理的解释和验证，得到了非常有意义的结果。
该项研究结果的启示及意义:
（1）结果一，肿瘤标本中PD-L1表达增高与女性、不吸烟者、腺癌和EGFR突变患者显著相关。此结果显示了PD-L1与患者临床病理和分子特征的关系，又可能提示了PD-L1抑制剂治疗的潜在获益人群。
（2）结果二，PD-L1表达的增加是通过EGFR信号通路，而这种EGFR信号通路是由
激活EGFR基因突变介导的。提示PD-L1表达和EGFR突变之间存在相关，支持抗PD-L1药物联合靶向治疗值得进一步研究（此为PD-L1抑制剂联合针对驱动基因靶向治疗奠定理论依据）。
（3）结果三，在EGFR敏感突变同时伴有T790M突变的EGFR-TKI获得性耐药细胞
系中，持续厄罗替尼治疗并不能降低PD-L1 持续的高水平表达。提示阻断PD-L1通路有可能是治疗EGFR突变患者TKI获得性耐药的方法。
（4 ) 结果四，NSCLC手术切除肿瘤组织中PD-L1表达水平较高者患者总生存期明显
缩短。这样一个发现提示我们PD-L1表达是否是独立的预后指标？或对于这样一群不良预后的亚组患者，针对PD-L1的抑制剂是否需较早期进行干预治疗（术后进行PD-L1抑制剂辅助治疗的理论依据。）
作为较早进行的探索性研究，基于认识和经验所限，研究存在不足如下：
（1）标本问题：该研究取得标本来自于近10年间（2000-2010年）手术切除的NSCLC
标本，因时间跨度长，标本质量受到影响，另外标本在获取、处理、贮存条件等方面可能有异，势必影响PD-L1检测结果。
（2）研究为回顾性、单中心，某种程度上标本量偏小，这些局限性非利因素对结果均可能产生偏颇。
（3）研究仅分析了PD-L1与EGFR突变的相关性，未观察与其它高频基因K-RAS、
ALK等的关系。
（4）因为研究纳入的患者均是手术切除的Ⅰ~Ⅲ期NSCLC标本，该结果是否能代表Ⅳ期NSCLC中PD-L1表达与临床病理分子特征关系并不明确。另外该研究亦无法评价EGFR突变患者PD-L1表达水平与EGFR-TKI治疗的疗效关系。
近年其它相关研究结果显示：
（1）PD-1和PD-L1的表达根据临床和生物学特征而存在差异。PD-L1阳性患者一般为女性、从不吸烟、组织学特征为腺癌、EGFR突变或ALK易位，而PD-1阳性患者多为男性、吸烟者、组织学特征为腺癌、KRAS突变。但也有研究显示，在组织学上，PD-L1表达与鳞癌相关。
（2）长期存放的的肿瘤组织并不适于检测PD-L1的表达。免疫组化检测PD-L1表达阳性标准的定义不一（阳性细胞比例>1%、2%、5%或？）。PD-L1/PD-1免疫组化的可信度还需要进一步验证，目前尚没有任何一种检测方法得到充分验证。
（3) PD-L1在不同肿瘤微环境中的表达存在差异，且在肿瘤细胞和肿瘤微环境中PD-L1的意义不同，并且不会在某一时间点停止表达。
（4）肺腺癌PD-L1阳性肿瘤约70%也是MET阳性、KRAS突变或EGFR突变。此外，PD-L1阳性NSCLC还表达其他免疫检查点如TIM3、LAG-3、B7-H3、B7-H4和CTLA-4。这些结果支持抗PD-L1或PD-1药物联合靶向治疗值得进一步研究。
（5）也有研究发现，在可以手术切除的Ⅰ期NSCLC（腺癌）患者中，PD-L1过度表达与高级分化和血管侵犯相关，这些患者无复发生存期较长。PD-L1表达与EGFR、KRAS、BRAF和ALK的表达无关。
（6）在EGFR突变且接受EGFR-TKI治疗的NSCLC患者中，PD-L1阳性患者的疾病进展时间显著长于PD-L1阴性患者。
综合目前的研究结果，本人认为该项研究所得结论与大部分研究吻合,值得借鉴，但需进一步在更广泛人群中进行验证。另外面对目前研究中不确定或似乎矛盾和有异的结论，未来需要明确如下问题：
（1）尽快标准化或统一PD-L1检测试剂、检测方法（敏感性、特异性）以及不同检测方法阳性判断标准。
（2）大样本、多中心、标准化方法对肿瘤组织的PD-L1表达进行检测，以明确PD-L1表达的状况与患者临床病理特征、分子标记的关系，PD-L1表达水平与疾病进展和预后的关系（预后指标？）。
（3）设计前瞻性研究，检测实时新鲜NSCLC标本PD-L1表达，以及表达水平与PD-L1抑制剂疗效的相关性，明确PD-L1可否作为PD-L1抑制剂治疗的疗效预测指标？
（4）明确免疫状态的动态变化（时间异质性），如PD-L1表达在疾病不同阶段是否一致？不同治疗方法介入后PD-L1表达是否发生改变？只有这些问题的了然才可能在最恰时间给予最合适的免疫靶向治疗。
（5）不同器官和组织的免疫应答存在差异，所以PD-L1在不同器官、不同组织、甚或同一器官同一组织不同区域中表达是否有差异（空间异质性）？这对于我们预测PD-L1表达与各肿瘤部位疗效至关重要。
（6）除外EGFR突变，PD-L1表达与其它驱动基因（如ALK、K-RAS、MET、ROS、RET、BRAF等）和肿瘤免疫因子（如TIM3、LAG-3、B7-H3、B7-H4、OX-40、KIR和CTLA-4等）的关系如何？这些相关关系是PD-L1/PD-1抑制剂与不同靶向和免疫药物联合治疗的理论基础。
总之，在免疫靶向治疗进入我们视野的短短几年内，许多研究者敏觉意识到并身体力行做了许多探索性的有意义的工作，虽然回头看这些研究设计还欠完美，结果也尚需进一步验证，但正是这些点滴和不确定给了我们更多的思考和启示，鞭策我们在未来研究中视野须高瞻拓宽，思路要清晰敏感，工作更待严谨完善。
[收稿日期]2015-07-28
[关键词] 非小细胞肺癌；PD-L1；EGFR突变
[中图分类号] R734.2
[文献标识码] A
DOI:10.3969/j.issn.1671-5144.2015.04.000
Association of PD-L1Overexpression with Activating EGFR Mutations in Surgically Resected NonSmall–Cell Lung Cancer // Reviewer：LIU Xiao-qing1,Literature Co-worker：Huang Shu-mei2
Key words:non-small cell lung cancer；PD-L1；；EGFR mutation；
Reviewer’s address: Department of Pulmonary Oncology，307 Hospital of PLA，Beijing100071，China
引用: 循证医学 2015, Vol. 15 Issue (4): 193-197
DOI: 10.3969/j.issn.1671-5144.2015.04.001
（转自 肺癌前沿）
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