人民卫生出版社出版的《脑胶质瘤基础与临床研究》，作者刘福生、金贵善；《神外前沿》发布此文，已获出版社书面授权及作者本人许可。
第十章：脑胶质瘤的化疗与耐药
第二节 改善脑胶质瘤耐药研究
三、 基 因 治 疗
1 自杀基因治疗
自杀基因 (suicide gene) 是来自某些病毒或细菌的基因可编码特定的酶从而将无毒的前体药物 转化成为产生有细胞毒性的抗肿瘤药物 将自杀基因导入恶性肿瘤细胞产生选择性抗恶性肿瘤作用有可能成为新一代癌症治疗方法目前备受关注 目前发现的自杀基因有多种其中研究和应用最广泛 为大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (cytosine deaminaseCD) 基因及单纯疱疹病毒脱氧胸腺嘧啶核苷激酶 (thy¯ midine kinaseTK) 基因其编码的酶可在细胞内催化无毒前体药物代谢活化前体药物产生高细胞 毒性的抗肿瘤药物 研究显示某些细菌及真菌表达 CD 基因而哺乳动物细胞却不表达该基因 CD 基 因所编码脱氨酶可催化相对无毒的前体药物5¯氟胞嘧啶 (5¯FC) 脱氨基从而活化产生高抗肿瘤 活性的5¯氟尿嘧啶 (5¯FU)5¯FU在细胞内进一步转变成5¯FdUMP从而抑制胸苷酸合成酶的活性使细胞处于早 S 期5¯ FU 还能掺入 RNA抑制 RNA 的合成最终起到杀伤肿瘤细胞的作用 TK 基因 编码磷酸化酶可表达生成胸苷激酶其将与核苷结构类似的原本无毒性的前体药物丙氧鸟苷 (GCV) 磷酸化为单磷酸核苷衍生物 (dTMP)然后可在内源性细胞激酶 (如磷酸甘油激酶、 丙酮酸激酶、 磷酸 烯醇式丙酮酸激酶) 作用下转化为三磷酸代谢形式 (dTTP)三磷酸 GCV 具有细胞毒性在细胞分裂 时掺入 DNA干扰 DNA 的合成达到杀死肿瘤细胞的目的 因哺乳动物细胞自身的胸苷激酶不能代谢 GCV因此 HSV¯ TK 自杀基因疗法只杀伤表达外源性 HSV¯ TK 基因的细胞 近年已有不少研究将肿瘤特 异性转录调控序列与自杀基因相连接实现自杀基因靶向性 如 AFP 基因启动子、 CEA 基因启动子、 人端粒酶反转录酶基因 (hTERT) 启动子均取得了增加肿瘤细胞杀伤敏感性的作用 研究发现 CD/5¯ FC 系统可以诱导人胶质瘤细胞的细胞凋亡其机制为 CD 能将无毒的 5¯ FC 转化为 5¯ FU5¯ FU 继续被 转化为单磷酸5¯FU和三磷酸5¯FU阻断胸苷合成酶合成及mRNA的转录 同样运用CD/5¯FU系统Lu (2005) 等证实转 CD 后的 U251 人胶质瘤细胞对于 5¯ FU 的敏感性大大提高 对于通常的自杀基 因系统不少研究者也致力于提高基因疗法的效率 Zhang (2008) 等利用多药耐药胶质瘤细胞中 MDR1 基因启动子的异常激活特性以实现双自杀基因在耐药胶质瘤细胞中的特异性表达并对肿瘤细胞 进行靶向性杀伤通过 MDR1 启动子控制的双自杀基因 / 前体药物系统对耐药细胞 C6 / ADR 细胞的抗肿 瘤效果比对非耐药细胞 C6 细胞的效果更为明显尤其是两种前体药物联合应用比单一用药效果好这 说明特异性启动子调控的自杀基因治疗能够进行选择性特异性杀伤同时证实了这种方法的靶向有效 性为解决胶质瘤等恶性疾病产生对化疗药物的耐药问题提供了一条新的治疗思路和途径
2 免疫基因治疗
免疫基因治疗是通过基因重组技术来增强机体的抗肿瘤免疫功能达到治疗肿瘤的目的 这主要包括 三个方面:
1) 增强免疫效应细胞功能的细胞因子基因疗法
肿瘤抗原提呈直接与肿瘤免疫相关增强抗原提呈能力的途径有细胞因子的刺激与树突状细胞的激 活 Nakahara (2003) 等发现 203G 细胞几乎全被骨髓衍生树突状细胞 ( Dendritic cellsDC 细胞) 和 T 细胞杀死同时观察到肿瘤特异的细胞毒性 T 细胞 (CTL) 活性及高水平的白细胞介素¯12 (IL¯12) 和 免疫反应性纤维结合素 (IF¯γ) 产物 近年来DC 的相关应用也在免疫基因治疗中成为研究热点Zhu (2005) 等将用鼠细胞集落刺激因子 (rrGM¯CSF)、 白细胞介素重组大鼠白细胞素4 (rrIL¯4) 激活 后的 DC 前体接种到大鼠颅内肿瘤中发现实验鼠的外周血液中 CD8 和 T 细胞水平明显升高诱导了淋 巴 T 毒性反应实验证明这是一种安全有效的颅内免疫治疗方案 Jin (2007) 等证实了 DC / C6 融合 瘤苗免疫接种大鼠对 C6 胶质瘤具有免疫保护作用对荷瘤大鼠有较好的免疫治疗作用DC 与反义 TGFβ1 基因修饰的胶质瘤细胞融合瘤苗能够明显延长动物的存活期为采用基因修饰的脑胶质瘤融合瘤 苗治疗脑胶质瘤提供了新思路
2) 调节增强抗原识别能力的细胞因子基因疗法
细胞因子参与免疫反应的多个环节 将 IL¯2 基因导入脑胶质瘤细胞可发现荷瘤鼠肿瘤病灶明显 缩小颅内胶质瘤明显坏死 目前已报道用于胶质瘤基因治疗的细胞因子很多有IFN¯γ、 IFN¯β、 IL¯ 1β、 IL¯2、 IL¯4、 IL¯7 和 MCSF 等但是有些细胞因子基因转导后其表达率并不高
3) 共刺激分子基因疗法
B7 共刺激分子作为 T 细胞活化的关键因素在肿瘤免疫中具有重要作用 目前研究发现肿瘤细胞 的免疫耐受与恶性肿瘤细胞表面 B7 共刺激分子缺失有关B7 共刺激分子的导入可激活 CD8 + CTL 细胞引起肿瘤消退
3 抑癌基因治疗
原癌基因和抑癌基因都是正常细胞内存在的基因它们在细胞的生长、 分裂、 分化和增殖中起着重 要的作用 抑癌基因亦称为抗癌基因是指正常细胞内存在的能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因 群 目前已分离克隆出 20 余种抑癌基因与胶质瘤相关的抑癌基因主要有 p53、 miRNA¯7、 PTEN 和 TIP30 等基因 。
p53 基因是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因具有修复错误基因、 诱导细胞分化及凋亡等生物学 作用转基因鼠模型已证实缺失 p53 基因的鼠可自发形成肿瘤 文献报道胶质母细胞瘤 p53 基因突变率 高达 35% ~ 60% 并提示 p53 基因突变主要发生在胶质瘤的早期可能参与了肿瘤的发生尤其是 p53 基因突变常见于恶性度高且易复发的胶质瘤 Perotin (2006) 等研究发现 p53 的缺失使作为胶质细胞瘤 的起源细胞增殖迅速 Senatus (2006) 等发现一种 p53 羧基末端肽可重新恢复 p53 的瘤细胞吞噬作用可以通过增强的对流释药系统穿越血脑屏障且具有较好的选择性所以可作为新的抗癌因子 Iwadata (1996) 等研究应用了 28 种抗癌药物对 p53 突变的胶质瘤标本进行体外药敏实验提示 p53 基因变异使 胶质瘤细胞对化疗敏感性降低而恢复 p53 基因可增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性 这几年有不少的研究 转向于 p53 在其他基因治疗中的辅助作用Mitlianga (2006) 等复制腺病毒和外源 p53 在胶质瘤细胞中 的同时转运发现细胞凋亡与细胞 p53 状态无关而腺病毒和 p53 的协同凋亡和溶瘤作用促进了瘤细胞 的死亡 相对于常规的 p53 基因治疗Ito (2005) 等研究发现 p53 促进细胞吞噬的调节基因 (PUMA) 能够特异性提高突变 p53 基因对胶质瘤细胞的吞噬作用却并不诱发对胶质瘤细胞凋亡耐受性
4 多药耐药相关的基因治疗
MDR 是指在化疗药物治疗肿瘤中发现的肿瘤细胞的非特异普遍耐药性主要是通过排出肿瘤细胞 内的药物而使肿瘤细胞产生耐药性 研究和克服肿瘤的耐药即逆转 MDR 的方法是当前肿瘤研究中的 热点也是临床化疗中亟待解决的问题 跟 MDR 相关的基因治疗一般集中在抑制肿瘤细胞的 MDR1 基 因表达从而增加常规化疗的效果 Matsumoto (2004) 等用一种反义寡核苷酸 (RP1) 作用于对依托泊 苷耐受的肿瘤细胞发现此反义寡核苷酸可能通过抑制 MDR 相关 mRNA 的转录从而抑制 MDR1 的表达而与对照组相比寡核苷酸作用的细胞对依托泊苷的敏感性增加生长受到抑制 郭华 (2005) 等则以 MDR1 基因 mRNA 为靶点设计合成两条反义肽核酸 (PNA) 序列利用杂交技术阳离子脂质体介导转 神经母细胞瘤耐药细胞株 (SK¯N¯SH)采用流式细胞术、 RT¯PCR和高效液相色谱等方法分别检测 反义 PNA 的转 效率、 转 前后细胞 P¯ gp、 MDR¯ 1 基因 mRNA 的表达及细胞内阿霉素 ( ADM) 浓度结果表明 MDR¯ 1 的反义 PNA 可使 SK¯ N¯ SH 细胞 P¯ gp 表达明显降低MDR1 mRNA 表达轻度降低细 胞内 ADM 聚集浓度明显增加 以上研究提示应用特异序列反义肽核酸以及反义 RNA 有可能逆转人脑 胶质瘤耐药细胞系的耐药性
亚硝基脲类药物以其高脂溶性和易于通透血脑屏障的特性被国内外学者公认为治疗脑胶质瘤的标 准化疗药物 但抗药性的产生限制了亚硝基脲类药物的临床效果并已成为胶质瘤化疗失败的主要原 因 金澎 (2003) 等模拟临床亚硝基脲类药物的用药程序在体外成功地建立了一株由 MGMT 介导的 人脑胶质瘤耐药细胞亚系 U251 / BCNU 利用基因重组技术构建了两个 MGMT 反义 RNA 的真核表达载 体分别针对于 MGMT mRNA 的全长序列和 5`端序列并转 U251 / BCNU 细胞观察 MGMT 反义 RNA 对 U251 / BCNU 细胞中 MGMT 表达水平及 U251 / BCNU 对亚硝基脲类药物敏感性的影响 结果显示MGMT 反义 RNA 能够在一定程度上抑制 MGMT 的表达水平提高肿瘤细胞对亚硝基脲类药物的敏感性这为临床上逆转胶质瘤的耐药表型提高亚硝基脲类药物的抗瘤效果提供了一条有效的途径 。
主要作者简介：刘福生，教授，主任医师，研究员，博士研究生导师。首都医科大学附属北京天坛医院神经外科、北京市神经外科研究所脑肿瘤研究中心，北京市卫生技术高层次人才——神经外科学科带头人。
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