借用大叔的一句话：愿赌服输的决定就是“对”的决定
突变是肿瘤发生的开始，然而肿瘤细胞通过累积突变获得生存或生长优势的同时，也可能是“自我毁灭”的开始[1]。突变都有可能是“非同义突变（nonsynonymous mutations）”，会改变氨基酸编码序列，导致肿瘤细胞表达正常细胞所没有的异常蛋白。这些异常蛋白，如果在细胞内（肿瘤细胞或APCs）被降解成短肽段（抗原表位），与MHC-I类或MHC-II类分子高亲和力结合，并以复合物形式呈递到细胞表面，被T细胞识别为“非己（non-self）”，引起T细胞活化，进而肿瘤细胞被效应T细胞攻击和清除（如图1）[2]。这种会引起T细胞活化的异常蛋白即我们所称的“新抗原（neoantigen）”，能够产生新抗原的突变即为具有免疫原性的突变（immunogenic mutation）。
图1. 新抗原表位形成及被T细胞识别的过程
一方面肿瘤通过不断突变演变和进化；另一方面，恰恰是突变产生的新抗原触发了T细胞抗肿瘤免疫的开始（cancer-immune cycle的第1步，如图2）。正是这种开始决定了肿瘤的免疫表型（Immune-desert tumor，Immune-excluded tumor，Infl-amed- tumor），决定了肿瘤对某种免疫治疗的敏感性[3]。肿瘤突变是随机概率事件，无法预测无法推算下一个突变是什么，这时肿瘤与免疫系统势必在进行一场豪赌：随机突变，会不会是免疫原性。现在我们手里握着I-O治疗（PD-1/PD-L1抑制剂）的赌注，我们又该怎么去下这个赌注？这是一个非常困难的赌注，有太多因素影响着突变是否能够产生新抗原。从肿瘤的“底牌”（突变）去分析，会不会增加胜算？那么我们知道的有哪些？
图2. Cancer-immune cycle and Cancer-immune set point
1. 突变数量
基于全基因组，全外显子或target panel测序，我们已经可以知道肿瘤基因组去除胚系突变（germline mutation）后的体细胞突变数量（somatic mutation），即肿瘤突变负荷（tumor mutation burden, TMB）。一般以肿瘤非同义突变总数量或每1Mb（1兆碱基）的突变数量来表示，10/1Mb的突变相当于肿瘤基因组编码区含有150个非同义突变[4]。然而，其中只有10%的非同义突变可以产生与MHC高亲和力结合的突变肽段[3]。而能够与MHC高亲和力结合的肽段又只有1%能够被肿瘤患者体内的T细胞识别[5]。也就是说150个非同义突变，最终可能也只产生1-2个新抗原。
虽然，从突变到产生新抗原，每一步都有很大折损，但理论上TMB越高，最后能够被T细胞识别的新抗原产生也越多。基于此，以我们非常熟知的每种肿瘤TMB来分析（图3）赌注： TMB>10/1Mb的黑色素瘤，经常会产生新抗原（frequently），对PD-1/PD-L1抑制剂敏感，这是黑色素瘤对PD-1/PD-L1抑制剂效果更好的原因之一；很大一部分肿瘤TMB> 1/1Mb，< 10/Mb，能够产生新抗原（regularly），对PD-1/PD-L1抑制剂可能敏感，有些需要联合治疗来增加新抗原的产生。例如在临床上，不经过筛选，确实也看到了NSCLC一部分患者对PD-1/PD-L1抑制剂有效；而肿瘤TMB<1/Mb，几乎不太可能产生新抗原（occasionally），对PD-1/PD-L1抑制剂不敏感。研究发现，TMB越高，确实肿瘤部位免疫杀伤活性越大（图4）[6]。临床研究的数据也表明多个瘤种PD-1/PD-L1抑制剂治疗ORR确实与TMB成正相关（图5）[2]。
图3. 肿瘤TMB及产生新抗原的可能性
图4. 肿瘤TMB与免疫杀伤活性的关系
图5. 肿瘤TMB与ORR的关系
2. 突变类型
基于TMB数量的分析，我们会提高赌注的胜算，但不会完胜，因为像上述的并不是所有的非同义突变都会产生被T细胞识别的新抗原。某些新抗原具有免疫优势，免疫系统会对这些新抗原“念念不忘”，而忽略掉另外一些新抗原[4]。如果知道某种突变类型与新抗原存在必然关联，那么我们的赌注可能会接近完胜。不幸的是，每个肿瘤突变产生的新抗原几乎是独一无二的存在[7]。在~20,000个黑色素瘤中发现了20种新抗原，但是不同肿瘤个体出现相同新抗原在的概率非常低（图6）[8]。虽然看到这样的结果很沮丧，但我们依然能够寻找到一些规律和提示：
图6. 相同新抗原出现在不同个体的概率
1）驱动突变很少产生新抗原
驱动突变形成新抗原是最理想的状态，因为同一个肿瘤内几乎所有肿瘤细胞都具这种突变，如果产生新抗原，那么针对新抗原的T细胞能消灭大部分肿瘤细胞。可惜的是，驱动突变很少产生新抗原，在~20,000个黑色素瘤中发现的20种新抗原，只有8%的新抗原来自驱动突变，而92%的新抗原来自非驱动突变（passenger mutation）（图7）[4]。这也是EGFR突变患者PD-1/PD-L1抑制剂疗效没有野生型患者好的原因之一：TMB低，且EGFR突变本身不能产生新抗原。而KRAS突变患者却中了“彩票”，KRAS G12D突变能够产生与HLA-C*08:02高亲和力结合的新抗原，而被T细胞识别（图8）[9,10]。而且，KRAS G12D突变产生的新抗原也不是独一无二仅出现在个别突变患者体内，已经发现同1种新抗原会重复出现在多个突变患者体内[7]。KRAS突变对PD-1/PD-L1抑制剂敏感更重要原因可能是能够产生新抗原，并非单纯是TMB高。KRAS突变类型与HLA结合的亲和力，及能不能定性预测PD-1/PD-L1抑制剂敏感性值得深入研究。
图7. 驱动突变和非驱动突变产生新抗原的比例
图8. KRAS G12D突变产生新抗原及被T细胞消灭的过程
2）与原编码序列差异越明显的突变越容易产生被T细胞识别的新抗原
突变与原编码序列差异越明显，产生异常蛋白外源性即“非己”特征越明显，免疫原性越强。肿瘤突变中95%的突变是点突变（substitutions），其余包括插入/删除突变（insertion/deletion），或移码突变（frame shift）[3,11]。很明显，插入/删除及移码突变导致氨基酸序列和空间结构改变会比较大，与MHC分子结合的亲和力会更强，被T细胞识别为新抗原的可能性越大（图9）[3]。在黑色素瘤的研究发现，某些对CTLA-4抑制剂持续应答的患者新抗原具有共同保守的4肽序列表位，与病原体序列非常相似，易于被T细胞识别，这可能是黑色素瘤患者对免疫检查点抑制敏感的真正原因，而不是单纯的TMB高。只是TMB越高，出现4肽序列表位的可能性越高[12]。这个时候我们回过头来想想，是不是只关注了各瘤种TMB高低那张图的上半部分，却忽略了下半部——各瘤种的突变类型完全不一样（图10）。基于突变类型的分析，是不是赌注的胜算会更大？
图9. 突变类型与免疫原性
图10. 肿瘤TMB及突变类型特征
虽然有很多未知，但我们对肿瘤突变的“底牌”，从数量到类型的了解会越来越清晰，我们可以测序知道所有会产生异常蛋白的突变；我们可以演算能与MHC分子高亲和力结合的肽段；我们可以检测这些肽段被T细胞识别的可能性；我们可以结合液体活检（ctDNA/CTC）动态监测突变的动态变化，预测耐药；甚至最终我们不再祈祷肿瘤患者像中了彩票一样有免疫原性突变，我们可以通过联合治疗增加或输入新抗原。我们越来越接近真相，免疫治疗这个赌注的胜算也越来越大。
参考文献：
1. Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 2011;144:646-74.
2. Yarchoan M, Johnson BA, 3rd, Lutz ER, Laheru DA, Jaffee EM. Targeting neoantigens to augment antitumour immunity. Nature reviews Cancer 2017.
3. Chen DS, Mellman I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature 2017;541:321-30.
4. Schumacher TN, Schreiber RD. Neoantigens in cancer immunotherapy. Science 2015;348:69-74.
5. Kristensen VN. The Antigenicity of the Tumor Cell - Context Matters. The New England journal of medicine 2017;376:491-3.
6. Rooney MS, Shukla SA, Wu CJ, Getz G, Hacohen N. Molecular and genetic properties of tumors associated with local immune cytolytic activity. Cell 2015;160:48-61.
7. Tran E, Robbins PF, Rosenberg SA. 'Final common pathway' of human cancer immunotherapy: targeting random somatic mutations. Nature immunology 2017;18:255-62.
8. Forbes SA, Beare D, Gunasekaran P, et al. COSMIC: exploring the world's knowledge of somatic mutations in human cancer. Nucleic Acids Res 2015;43:D805-11.
9. Tran E, Robbins PF, Lu YC, et al. T-Cell Transfer Therapy Targeting Mutant KRAS in Cancer. The New England journal of medicine 2016;375:2255-62.
10. June CH. Drugging the Undruggable Ras - Immunotherapy to the Rescue? The New England journal of medicine 2016;375:2286-9.
11. Vogelstein B, Papadopoulos N, Velculescu VE, Zhou S, Diaz LA, Jr., Kinzler KW. Cancer genome landscapes. Science 2013;339:1546-58.
12. Snyder A, Makarov V, Merghoub T, et al. Genetic Basis for Clinical Response to CTLA-4 Blockade in Melanoma. The New England journal of medicine 2014.
13. Lawrence MS, Stojanov P, Polak P, et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature 2013;499:214-8.
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