乳铁蛋白的发展历史

乳铁蛋白非血红素铁结合糖蛋白

科普中国 | 本词条由“科普中国”科学百科词条编写与应用工作项目审核审阅专家 安毛毛

乳铁蛋白是一个分子量为80 kDa的铁结合糖蛋白，属于转铁蛋白家族[1]。乳铁蛋白在初乳和牛奶中含量高，在眼泪、唾液、精液、鼻和支气管分泌物、胆汁和胃肠液等粘膜分泌物中的含量较低。此外，乳铁蛋白也是中性粒细胞的组成成分[1]。1939年Sorensen等人在分离乳清蛋白时得到一种红色蛋白，Polis等人在分离Lp时也得到部分纯化的红色蛋白，但至1959年Groves用色谱得到纯的红色物质后，才确认这种红色物质是一种与铁结合的糖蛋白，称之为乳铁蛋白。乳铁蛋白不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大生物功能，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂。中文名乳铁蛋白[2]外文名lactoferrin，LF[1]功能抗菌、抗癌、抗病毒、调节免疫[1]分子量80 kDa[1]发现时间1960年[3]简介来源乳铁蛋白（Lactoferrin）是由科学家Johanson Bengt于1960年在母乳中发现的[9]。随后Baggin等科学家在一些生物体的体液和各种细胞中发现了这种蛋白质并开始了大量研究。研究表明，乳铁蛋白LF是动物初乳中的天然蛋白质，是一种多功能蛋白质，具有广谱抗菌，抗病毒感染作用，能调节体内铁的平衡;调节骨髓细胞的生成，促进细胞的生长;调节机体免疫功能，增强机体抗病能力;抑制人体肿瘤细胞的作用;能同多种抗生素及抗真菌制剂协同作用，更有效地治疗疾病。分布和含量乳铁蛋白广泛分布于人和哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中（包括泪液、精液、胆汁、滑膜液等内、外分泌液和嗜中性粒细胞），但乳汁中含量较高[10]，其中牛初乳中乳铁蛋白含量最高。血液中乳铁蛋白主要由多核细胞分泌，骨髓、唾液腺及子宫内膜等也能分泌少量乳铁蛋白[4]。人乳中乳铁蛋白浓度约为1.0-3.0mg/mL，是牛乳中的10倍（牛乳中含量为0.02-0.35mg/mL），占普通母乳总蛋白的20%，在泌乳期间，乳铁蛋白含量随着泌乳时间的不同而发生变化，如人初乳中乳铁蛋白可达6-14mg/mL，常乳期降至1mg/mL。母牛产后第一天初乳中的乳铁蛋白含量可达1mg/mL。当奶牛牛奶中乳铁蛋白在泌乳末期的含量又会上升[4]。分子结构乳铁蛋白（牛）是一条具有703个氨基酸残基的多肽链，该链折叠成两个基本对称且高度同源的叶片状结构（N-叶和C-叶）[5]。研究表明这一结构可能是在进化过程中由于基因重叠形成的。N-叶结构包含了氨基酸1～332，C-叶结构包含了氨基酸344～703，两个结构通过铰链区进行链接，大小均约40kDa。N-叶和C-叶又可以被对应的分为N1、N2区和C1、C2区，N叶与C叶相比携带更高的正电荷。N-叶结构被证实与提高乳铁蛋白的抗菌活性相关，C-叶结构可以在胃病、糖尿病和角膜损伤的治疗中发挥作用。乳铁蛋白具有两个金属离子结合位点，每个位点含有两个酪氨酸、一个天冬氨酸和一个组氨酸，能够可逆性结合一个Fe3+离子和一个CO32-离子。由于乳铁蛋白与铁离子的复合物呈红色，因此也被称为“红蛋白”[3]。乳铁蛋白三级结构理化性质乳铁蛋白与铁离子的亲和力很高，是转铁蛋白的250～300倍。根据乳铁蛋白结合铁离子的差异，可以将其分为3种类型：缺铁型、铁半饱和型和铁饱和型。不同类型的乳铁蛋白具有不同的抗巴氏杀菌热变性的能力，其中铁饱和型抗性最强，缺铁型抗性最弱。乳铁蛋白不仅可以结合Fe3+和Fe2+，还可以与Cu2+、Mn2+、Zn2+结合[3]。关于乳铁蛋白的热稳定性，研究发现，72℃保温20s或135℃保温8s的热处理几乎不影响乳铁蛋白的铁结合能力，但若在两种温度下处理的时间延长则会降低铁结合能力。85℃保温10min的热处理强度也不会影响乳铁蛋白的抑菌活性。另外，有研究表明在pH2.0或者pH3.0的条件下，120℃处理5min后，乳铁蛋白发生降解但是降解产物的抑菌活性比处理前要高。这一实验结果使人们发现了乳铁蛋白活性多肽的存在。乳铁蛋白对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑菌效果，但是对革兰氏阴性菌的作用比较强。乳铁蛋白的铁饱和度与抑菌性呈负相关。环境pH值变化影响乳铁蛋白对革兰氏阳性菌的抑制作用，对革兰氏阴性菌影响不大。当pH为7.5～8.0时，抑菌效果最佳。乳铁蛋白经过70℃以下的巴氏杀菌后抑菌活性没有影响；HCO3-浓度增加，有利于增强其抑菌性[3]。生物学功能乳铁蛋白可以响应各种生理和环境的变化，因此它被认为是先天防御系统的关键组成成分。乳铁蛋白对多种细菌、真菌、酵母、病毒和寄生虫表现出强大的抗菌活性。它还具有抗炎和抗癌活性，并具有多种酶功能。乳铁蛋白在维持体内细胞铁水平中起关键作用[5]。抗菌活性乳铁蛋白最早被发现并广泛研究的生物学功能是它的抑菌能力。乳铁蛋白具有广谱的抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的能力，可以有效抑制大肠杆菌、伤寒沙门杆菌、链球菌、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌的生长。临床上给予患者乳铁蛋白口服治疗后，减少了胃肠道细菌的感染，但不影响乳酸杆菌和双歧杆菌的生长[3]。通常认为，乳铁蛋白是通过螯合铁离子，竞争性地剥夺细菌生长所需要的铁元素，从而抑制细菌的生长。也有研究表明，乳铁蛋白能与脂质A结合，促使脂质A从革兰氏阴性菌的细菌壁上剥离出来，从而导致细菌死亡。乳铁蛋白的N-末端有一段编码乳铁素的序列，而乳铁素是一种具有天然抗菌活性的抗菌肽[3]。抗病毒活性乳铁蛋白可以帮助机体抵御多种病毒的感染。由轮状病毒、肠道病毒和腺病毒引起的肠道感染都可以用乳铁蛋白进行治疗，在感染发生初期，乳铁蛋白可以抑制腺病毒的复制，阻止病毒吸附于靶细胞上从而防止感染。在研究引起感染性腹泻的诺如病毒时发现，乳铁蛋白可以减轻细胞毒素的损伤、降低病毒细胞的数量、阻止病毒与细胞的粘附、抑制病毒的复制并增加抗病毒细胞因子的表达，从而杀灭诺如病毒。乳铁蛋白可以抑制HIV-1逆转录酶和剪接酶的活性，阻止HIV病毒感染细胞。除此之外，乳铁蛋白还可以抵御HSV-1、HCMV、HCV等病毒对机体的入侵。也有观点认为，乳铁蛋白并无直接的抗病毒效果，而是间接地通过免疫系统的抗病毒反应以达到抗病毒的目的[3]。抗真菌活性人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白以及乳铁蛋白衍生肽都具有针对人类病原性真菌（特别是白色念珠菌和其他几种念珠菌）的体外活性。乳铁蛋白可以同抗细菌一样，通过改变细胞表面的通透性来杀死白色念珠菌和克鲁斯梭菌。乳铁蛋白可以改变新隐球菌和白色念珠菌的细胞质和线粒体膜的通透性。乳铁蛋白的抗真菌作用机制是通过与细胞表面相互作用来实现的而不是铁的剥夺[5]。抗癌近年来，乳铁蛋白的抗癌作用已经被广泛报道。给啮齿类动物口服牛乳铁蛋白，可以抑制由化学法诱导的肿瘤的形成。临床试验证实乳铁蛋白可以抑制肿瘤的发生和发展。乳铁蛋白具有调节癌症中细胞因子产生能力。乳铁蛋白在体外诱导细胞凋亡并阻止肿瘤生长。它也可以在恶性细胞的细胞周期中阻止其从G1到S的转变。此外，用重组人乳铁蛋白治疗小鼠肿瘤可以抑制肿瘤生长，增加抗癌细胞因子（如IL-18）的水平，并激活NK细胞和CD8+ T淋巴细胞。最近，临床试验证明，牛乳铁蛋白可抑制结直肠癌，而人乳铁蛋白可降低结肠癌发生的风险。对于乳腺癌，乳铁蛋白能够抑制其肿瘤细胞的生长，向乳腺癌细胞系（MDA-MB-231）的培养基中添加外源性乳铁蛋白会导致细胞周期停滞在G1/S过渡期。此外，乳铁蛋白诱导HeLa细胞中Smad-2的生长停滞。尽管研究人员获得的结果表明，乳铁蛋白具有明显的抗肿瘤作用，但其发挥这些作用的机制尚不完全清楚[5]。免疫调节和抗炎活性由于乳铁蛋白在机体的外分泌液中广泛分布，因此可以作为机体的第一道天然免疫屏障参与免疫调节。乳铁蛋白是重要的炎症反应调控因子之一，是参与调节免疫系统的重要成分，能够保护机体抵抗微生物的感染，降低由大肠杆菌、传染性腹泻的发生率，改善刚断奶小猪的生长状况。对免疫系统未发育完善的新生儿而言，富含乳铁蛋白的初乳可以帮助其激活并调节免疫系统的功能，同时促进自身免疫系统的迅速建立。口服牛乳铁蛋白增加淋巴结和脾脏中细胞的数量，提高腹腔巨噬细胞和脾脏NK细胞的活性，增强Th1型T细胞IL-12和IFY-γ等细胞因子的产生。乳铁蛋白通过阻断细胞凋亡的信号通过，抑制免疫细胞的程序性细胞死亡；还可以通过与抗原层递细胞的交互作用，调节T淋巴细胞的成熟和分化、Th1/Th2细胞因子的平衡[3]。酶活性乳铁蛋白可在某些催化反应中充当酶的功能。乳铁蛋白和核糖核酸酶A之间的某些基序有显著相似性。乳铁蛋白具有DNA结合特征，并可以在特定DNA序列的转录激活中发挥作用或作为信号转导介质。在所有的牛乳蛋白中，乳铁蛋白具有最高的淀粉酶和ATP酶活性，然而，它们并不是唯一的酶促活性。乳铁蛋白表现出的各种各样的活性归因于其蛋白质特性的变化，乳铁蛋白具有多种同工型，不同的糖基化程度，不同的三级结构以及低聚程度[5]。分离方法传统方法纯化乳铁蛋白的方法有许多种，许多公司选择阳离子交换色谱系统来大范围的获得乳铁蛋白。对于乳铁蛋白的分离纯化开始于上世纪80年代，许多公司都致力于开发获得高纯度乳铁蛋白工艺。对乳铁蛋白分离纯化的方法从最初的阳离子交换到亲和层析再到免疫学方法，以及各种方法的组合对于分离纯化乳铁蛋白都有个有利弊[6]。阳离子交换色谱。利用阳离子交换色谱从原料中分离获得乳铁蛋白是传统的方法，其优点是操纵简单、步骤少、持续进样和容易扩大等优点。但是，传统色谱层析用于快速的和大量的从乳清蛋白中回收乳铁蛋白时表现出很多缺点，如色谱层析材料的污染、循环时间长、液滴通过色谱柱时压力大以及复杂的控制系统，而且原料中许多与乳铁蛋白带有相同点和及相似等电点的杂蛋白在分离纯化乳铁蛋白时被一同洗脱下来，所以获得的乳铁蛋白纯度低，费用昂贵和相对低的产量[6]。膜吸附。由于乳铁蛋白的热稳定性差，而膜分离是一个不需加热，没有相变并且不需要化学试剂的分离过程。因此，该方法可以最大限度的保持乳铁蛋白的生物活性，使之成为分离回收 乳铁蛋白的一个优势。Kerstin Plate 等研究是否能利用膜技术将乳清中乳铁蛋白回收以及实验室水平的设备是否可以直接应用于工业化。试验用的膜面积从15cm2上升到4m2，其试验结果表明，最佳条件是选用 Sartobind S 系统，膜面积扩大到2m2，8 个循环不用清洗。Almécija 等使用300 kDa 的陶瓷微孔膜从乳清中分离 Lf，研究表明，获得乳铁蛋白最佳的溶液 pH 值分别为5和10，前者可以获得 乳铁蛋白，而后者可以使乳铁蛋白滞留在原乳清中。为了克服膜吸附无法区分近似分子量的弊端，Brisson 等使用荷电膜和电场的结合，电场使蛋白的移动起到了重要的作用，虽然解决了一部分纯度问题，但是溶液表面发生的电解反应对于 Lf 的分离起到了负面的影响[6]。电分离。电分离技术是利用分子大小和其自身所带电荷的不同对蛋白分子进行分离的技术，电流可以使得分离速度加快。与传统压力驱动方法相比，电场的应用的优势在于提高了乳铁蛋白分离的速度，但同时降低了其纯度，原因是由于在分离 Lf 的同时其他乳清蛋白的迁移和蛋白间相互作用。电分离与微滤膜结合可以克服低选择性和溶液污染等不足。N Ndiaye 等利用此方法对乳铁蛋白进行了分离，乳铁蛋白的最佳分离条件为 pH=3.0，以 2 g/L 的 KCl 溶液为溶液时，其最佳条件为 1.5×10-8m2/(V·s)；以去离子水为溶液时，其最佳条件为 3.0×10-8m2/(V·s)。结合 500 kDa的超滤膜，经过 4 h 的处理后，迁移率达到 46 %，产量为 15 %。该方法的不足是，在 pH=3.0 的时候，β-乳球蛋白也会一同被分离出来[6]。新方法由于乳铁蛋白的广泛应用，人们对其纯度的要求越来越高，但乳清中的一些蛋白如乳过氧化物酶，该蛋白和乳铁蛋白具有相似分子量和等电点。另外，一些学者还指出乳铁蛋白结合蛋白在纯化乳铁蛋白的同时也被纯化出来，其中包括核糖核酸酶-4、血管生长素、嗜中性粒细胞凝胶酶相关钙脂蛋白和成纤维细胞生长因子结合蛋白等。这些微量蛋白与乳铁蛋白可能涉及到许多乳铁蛋白体内功能多样性的生理学活性。常规的疏水相互作用、亲和色谱、分子排阻、超滤和膜过滤等过程复杂，加之选择性低，因此一些选择性高的方法被开发出来[6]。羟磷灰石法。Paul K Ng 等使用一种混合模式色谱-陶瓷羟磷灰石层析。该方法可以一步将乳清中的 Lf、Lp 和其他球蛋白都分离，然后通过梯度洗脱获得 Lf。试验结果表明，一个 80 L 的羟磷灰石柱一小时可收集 0.32 kg的 Lf，得到的 Lf 经验证不含任何的 Lp 活性。产量高、费用低和步骤简单使得该操作具备所有的用于有效地大规模生物技术产业特点。羟磷灰石纯化过程需要大量的水来有效地分离大分子，产品回收率依赖于使用缓冲液的量、该方法没有办法区分具有相似水合粒径的分子，因此产品的纯度可能会受到影响。另外，乳清中不同的蛋白间相互作用使得该过程很难预测[6]。噬菌体蛋白-亲和色谱。亲和柱一般是基于抗原抗体反应，具有特异性结合的配体被广泛应用于不同的分离纯化目的。亲和柱的选择高有利于获得纯度高的蛋白，然而配体本身昂贵、根据分离不同的目的蛋白，配体本身需要重新进行筛选和纯化、配体的易碎性降低了柱的使用寿命、配体降解导致产品的污染以及配料体的泄露和毒性问题是限制其应用的原因。噬菌体作为多配体的表达者，其谱库量大并且针对诸如乳铁蛋白、胰岛素和血清白蛋白等的噬菌体已经成功的被选育。亲和色谱中的肽配体可以用常规的方法或者固相直接合成法固定于基质上，用于目的蛋白的分离纯化。人工合成的多肽与宿主表达的多肽往往表现出不同的性能，因此 Wim Noppe 等成功选育出了4 株表达能够结合 Lf 六肽的噬菌体，然后将长度 1 μm噬菌体直接固定化到大孔基质上用于 Lf 的分离纯化。其试验表明，利用该亲和方法可以一步法提取 Lf，且其纯度高于 95 %。该方法的优点是基质孔洞不易堵塞、操作过程简单、可持续性、回收速度快。且噬菌体表达相比单克隆抗体要便宜及步骤简单[6]。磁性纳米粒子。磁性纳米粒子用于分离 Lf 的好处在于，当外加电场时，磁性纳米粒子瞬间带有磁性，可以在电场作用下泳动。当撤去外加电场时，磁性立即消失，这样有利于磁性纳米粒子的分离，再配合以膜等技术，最终获得目的蛋白。Bo-Hung Lai 等将伴刀豆蛋白 A 结合在 Fe3O4 磁性纳米粒子上，获得了平均直径为（11.74±3.86）nm 的近超顺磁性粒子。经过试验证明，该粒子在分离 Lf 时的最佳条件为 pH 值=7，温度 25 ℃，平衡时间在 5 min之内，最大吸附能力和平衡常数分别是 59.2 mg/g 和0.010 3 L/mg。Lin Chen 等以肝素作为亲和配体，用磁性亲和方法分离 Lf，肝素在对于 Lf 的结合能力为 0.92 mg/g。试验以 NaCl 作为洗脱液，通过一步法非常高效地从酸性乳清中回收 Lf，最高的结合能力是 164 mg/g。且获得的 Lf 的纯度要高于商业标准。通过对比竞争吸附试验证明磁性方法是一种潜在的能够快速和大规模生产方法[6]。应用乳铁蛋白的广泛生物学功能决定了其在化妆品、食品、动物生产、医疗等领域中的应用，可作为抗氧化剂、免疫促进剂、补铁剂、药物载体等[7]。化妆品
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