长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一类长度超过200nt、不编码蛋白的RNA，在表观遗传及转录后水平调控基因表达，与人类疾病的发生、发展和防治有密切联系。研究lncRNA想发高分文章，运用RNA-seq技术筛选特异性lncRNA只是第一步，后期实验验证才是直接影响文章水平的关键。小编为大家总结了lncRNA验证涉及实验概念，赶紧先睹为快~
SEE MORE →
目的：确定lncRNA 5’和3’末端序列，进而获得lncRNA的全长信息。
原理：在cDNA合成或第二链cDNA合成的过程中末端序列外侧引入接头序列，通过接头引物和基因特异性引物进行PCR扩增，PCR产物经克隆测序获得末端序列信息。
目的：IP是研究RNA蛋白相互作用的重要手段，利用RIP可以研究在体内蛋白是否与lncRNA发生相互作用。
原理：利用目的蛋白的抗体免疫沉淀蛋白RNA复合物，从沉淀的RNA蛋白复合物中纯化RNA，进行定量PCR分析。
目的：检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种方法。
原理：荧光素酶可以催化荧光素(luciferin)氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光，进而检测转录因子与目的基因启动子区DNA是否发生相互作用。
目的：RNA pull-down实验主要用来鉴定与目的lncRNA结合的蛋白配体。
原理：蛋白与生物素标记的RNA孵育结合，富集的蛋白通过SDS-PAGE分离，最后选择特异性蛋白条带进行质谱鉴定。
目的：ChIP主要用于研究lncRNA—蛋白质—染色质DNA相互作用，探究 lncRNA对特定染色质修饰蛋白或转录因子的调控作用。
原理：在活细胞状态下固定蛋白－DNA复合物，超声将DNA随机打断为一定长度范围内的染色质小片段，再通过抗体捕获蛋白－DNA复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。
小编结合两篇系统性研究lncRNA的经典案例，从分子机制研究及肿瘤基础研究两方面，与大家聊聊lncRNA测序及后期验证该怎么做。
lncMyoD通过阻碍IMP2介导的mRNA翻译调控骨骼肌分化[1]
期刊：Developmental Cell
IF：9.338
本文应用RNA-seq技术，寻找成肌细胞与早期肌管的差异分子，发现并鉴定出lncMyoD，并从其对邻近靶基因MyoD与下游基因调控方式两方面探讨lncMyoD的调控机制。
发现和鉴定lncMyoD
A. RNA-seq寻找差异分子；
B. 根据基因位置关系确定lncMyoD。
lncMyoD序列及表达模式特征
A. RACE确定lncMyoD序列；
B. lncMyoD表达的时间、空间及组织特异性分析；
C. lncRNA被定位于细胞核，在成肌细胞及肌管中特异性表达并具有时间特异性；
D. lncMyoD编码蛋白能力生物信息学预测及实验验证，无蛋白编码能力。
lncMyoD是MyoD的直接靶标
A. 沉默lncMyoD不影响MyoD基因表达，而沉默MyoD基因可使lncMyoD表达下调，从而得出结论：MyoD在lncMyoD的上游；
B. 通过CHIP和荧光素酶报告基因实验，验证MyoD可介导lncMyoD的转录激活，从而上调lncMyoD表达。
A. 为寻找lncMyoD调控的下游靶基因，通过RNA pulldown检测到IMP2蛋白；
B. lncMyoD 表达沉默后IMP2蛋白水平上调。（研究发现IMP2蛋白能直接结合并调控IMP2 mRNA，从而增加其自身mRNA的稳定性或翻译。 lncMyoD表达沉默增加了IMP2蛋白和IMP2 mRNA的结合稳定性，使得IMP2蛋白水平上调。）
C. lncMyoD负向调控IMP2介导的增殖基因（N-Ras和c-Myc）的翻译。（lncMyoD竞争性的结合IMP2蛋白，使得IMP2介导的增殖基因（N-Ras和c-Myc）的翻译受阻。）
Lnc-GCASPC作为MiR-17-3P靶标，负向调控胆囊癌PC蛋白依赖性细胞增殖[2]
期刊：Cancer research
IF：8.556
本研究表明lncRNA-GCASPC在肿瘤组织中表达量下调，在胆囊癌（GBC）发展中发挥关键作用。lncRNA-GCASPC是miR-17-3P的靶标基因，且能够负向调控丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase，PC）的表达，为揭示胆囊癌中lncRNA调控细胞增殖机制，阐明其致病机制提供新的基础。
分子筛选及鉴定
A. 针对5个胆囊癌患者的癌及癌旁组织进行表达谱测序，分析差异表达的lncRNA及mRNA；
B. 应用qRT-PCR在15对癌及癌旁组织样本中验证，筛选出肿瘤组织中显著下调且保守的lncRNA-GCASPC（以下简称GCASPC）。加大样本量验证，证实GCASPC在131个GBC病人组织样本中显著下调，并与病人预后相关；
C. 生物信息学预测蛋白编码能力，确定lncRNA-GCASPC无蛋白编码能力；
D. 鉴定lncRNA表达特异性，定位于细胞质。
细胞及动物实验的功能验证
A. 细胞实验：过表达GCASPC能够抑制细胞增殖，敲除GCASPC能促进肿瘤生长；
B. 动物实验：GCASPC表达与肿瘤大小相关，且与肿瘤分期、预后相关。其表达量越高，预后效果越好。
lnc-GCASPC下游靶分子的功能验证
A. 通过RNA pull-down及质谱检测，发现了下游靶分子-丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase，PC）简称PC蛋白；
B. 过表达GCASPC，PC蛋白表达活性下降、mRNA水平无变化，表明GCASPC可能是通过翻译或翻译后调控PC蛋白的表达活性。
lnc-GCASPC上游分子miR-17-3p研究
A. miRDB预测到miR-17-3p可与GCASPC配对，并通过荧光素酶报告基因验证两者具有结合作用；
B. 干扰/过表达miR-17-3p能影响GCASPC的表达，而干扰/过表达GCASPC不引发miR-17-3p的表达变化，验证GCASPC是miR-17-3p的靶基因；
C. 验证miR-17-3p的功能，敲除后可抑制细胞增殖。
安诺基因lncRNA测序拥有丰富的项目经验，全面的分析内容（多组学联合+ceRNA分析），更综合下游合作公司资源，涵盖 lncRNA筛选、分子生物学鉴定、直接靶点筛查、生物学功能研究、lncRNA-蛋白-DNA/lncRNA-RNA等多项功能验证研究，为您提供全面的一站式服务！
[1]Gong, Chen guang, Li, et al. A Long Non-coding RNA, LncMyoD, Regulates Skeletal Muscle Differentiation by Blocking IMP2-Mediated mRNA Translation[J]. Developmental Cell, 2015, 34(2):181–191.
[2]Ma M Z, Zhang Y, Weng M Z, et al. Long Non-coding RNA GCASPC, a Target of miR-17-3p, Negatively Regulates Pyruvate Carboxylase-Dependent Cell Proliferation in Gallbladder Cancer[J]. Cancer research, 2016, 76(18).
联系客服
