Q问题： 普通PCR 和 QPCR 引物是否一样？
A回答： 二者的设计原则有相同也有不同；
相同处：
· 序列的查找是一致的；
· 序列选取应在基因的保守区段；
· 选取合适的扩增片段大小
· 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；
· 避免引物自身形成环状发卡结构；
· Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；
· 引物之间的TM相差避免超过2℃；
· 引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；
不同处：
Real time PCR 引物
· PCR产物长度；real-time PCR要求在300bp以内，一般首选80-150bp 之间；
· 多对目的基因同时扩增，文献上查来的引物条件会不同，需要设计尽可能条件一致的引物；
· 目的基因含量比较低时，需要设计灵敏度比较高的引物；
· 相对电泳法，Realtime PCR灵敏度比较高，对引物的要求更高，引物二聚体要少；熔解曲线要求单一产物；
· Realtime PCR的目的是进行定量或者相对定量，对扩增的效率有要求；对引物的二级结构要求高；
普通PCR引物：
· 根据实验的要求不同，长度一般是从150bp到几千bp不等；
· 对二级结构要求没有realtime PCR 高；
· 对扩增效率要求不高；
· 可以选用梯度PCR仪，选择不同退火温度，对引物退火温度要求不需要一致；
验证时不同：
引物的特异性（相同点）：
Ø 引物的特异性在使用前用blast来保证；
不同点：real time PCR
Ø 在实验结果中通过熔解曲线来验证；
Ø PCR的特异性产物峰应与引物报告中的PCRproduct 相差在两度之内；
普通PCR通过产物的长度，跑条带，来鉴别产物的特异性；
Real time PCR可以通过扩增曲线，熔解曲线分析来鉴别产物的相对量，同时也可以对终产物进行电泳分析，更全面，更科学！
