前言
上一期我们解读了一篇发表在《美国人类遗传学》杂志的调查报告，介绍了美国临检实验室遗传病检测现况（原文），引起了国内各位同行广泛关注和探讨。接下来，我们还会陆续推出与遗传检测、咨询实践相关的一系列文章，深度关注遗传病领域。
上一期提到ACMG-AMP变异解释指南在实践中出现了各实验室对同一变异位点判读结果不一致的情况，主要原因之一就是关于PP1证据（共分离证据）的使用缺乏统一标准。原文提到“存在多个患者的遗传病家系中，待评估的遗传变异与疾病共分离，是支持该变异致病的证据之一。如果共分离可能性数据增加，则该证据强度可以提升”，并给出了推荐的统计学工具“Bayes factor (BF)”[Bayrak-Toydemir et al，2008，PMID：18495117]。但这个工具比较复杂，难以在普通实验室实现，同时也缺乏相应的定量标准去指导具体的共分离证据的使用（即什么情况下将证据强度提升，以及提升到什么强度）。为了解决这一问题，AJHG杂志六月刊上提供了一种较为简单的共分离可能性的计算方法，并提供了对应不同证据强度的定量标准。（原文链接），这一方法与Association for Clinical Genetic Science（ACGS）变异致病性判读指南（2013）中所使用的方法（Simplified method for segregation analysis，SISA）相似，有兴趣的朋友可以参考。
接下来我们一起看看AJHG这篇文章是如何简易地进行共分离分析的。
主要内容
先证者所携带的目标变异（即待评估变异），1). 为罕见变异，且来自于同一个祖先（即不是由外来个体引入的）；2). 疾病为完全外显（full penetrance）。
在基本假设的条件下，计算随机情况下，出现已观测到的变异-表型状态【即家系的共分离状态】的可能性（probability），用N值表示，可以用下面的公式进行计算：
N=（1/2）^m
m为家系中观察到的变异（此信息确定可获得）间的减数分裂次数（文中没有详述该值的计数方法，个人觉得可以简单理解为患者数量-1，刚好和SISA方法中的定义一致，但要注意同卵双胞胎的特殊情况）。
如果一个家系中一个患者（祖母）+三个父辈的兄弟姐妹+一个孙辈（共五个患者），其m值为5-1=4。
以一个最简单的家系为例，一个患有显性遗传病的先证者+患同样疾病的父亲（或母亲）都携带有某个待评估的变异，这种情况下，m值为2-1=1，N值为（1/2）^1=1/2。【可以理解为在先证者基因型确定的情况下，其家庭成员中同样的患者均携带有该变异的几率】。
以此类推可以在更大更复杂的家系中进行扩展。
1）对于出现于多个家系中的同一个变异位点的N值可以直接进行相乘。【按照独立事件处理】
2）隐性病家系的N值计算。例如，对于携带有相同基因型的兄弟患者（基因型为纯合或复合型杂合变异，父母为两个变异的携带者），该家系的N值为（1/2）^2=1/4；如果携带相同变异的同胞数量增加为3人，则N值为（1/2）^4=1/16。【注意：对于隐性疾病来说，纯合或复合型杂合导致疾病发生的情况下，在先证者基因型确定的情况下，第二个患者（如兄弟）也是同样基因型的概率需要按照两次减数分裂事件进行计算（1/2）^2=1/4，每个患者对N值的贡献为1/4】
3）该算法与之前提到的准确性更高复杂的BF算法之间的关系大致是：N=1/BF。【本文以BF值为准来评估N值算法的准确性】
4）家系内的正常个体也可以提供共分离的信息，其提供的可能性为1-正常个体携带有待评估变异的概率（之后会有举例说明）。
4. 对应的证据强度，可以参考下表：
举例说明
该论文以BF算法计算所用家系为例进行了详细的说明（仅选取了其中的三个家系）
例1
家系8中，共有3个已明确基因型和表型的个体（父母基因型无法推测，故不计入），II1为先证者，II2和II3患者带有与先证者相同的变异；
m值为2，则N值为（1/2）^2=1/4（结果与1/BF相近）；
根据证据的划分标准，此家系不提供ACMG相关的致病性证据。
例2
家系4中，先证者II3，而III1，III2，III3，III4患者并携带有与先证者相同的变异（虽然II1和II6没有直接的信息，但通过子女与先证者的基因型情况，可以判断出，也极可能携带有同样的变异）;
m值为6，其N值为（1/2）^6=1/64（结果与1/BF相近）;
根据证据的划分标准，此家系提供ACMG相关的强致病性证据。
例3
家系3中，先证者IV1，而III5为患者且携带有与先证者相同的变异，根据基本假设与遗传规则，可以判定，II2，II3，III1也极有可能带有与先证者相同的变异，患者的N值可以计算为（1/2）^4；
对于家系内的正常人来说，IV4的N值可以计算为1-1/2=1/2，IV5的N值可以计算为1-（1/2）^2=3/4（即II2为携带变异的患者，III4基因型未知的情况下，IV5个体的携带待评估变异的可能性为（1/2）^2，其不携带的可能性为1-（1/2）^2）。总的N值进行相乘计算：（1/2）^4*（1/2）*（3/4）=3/（2）^7=3/128（原文的正文处可能有误）。
针对此处的IV3和V1携带变异但尚未发病的携带者，作者推荐进行直接赋值（1/4，1/3或1/2），本例中采用了 1/3。加上前面已完成计算的家系内患者与正常人所提供的N值，共同计算可得总N值约为1/128（结果与1/BF相近）。
根据证据的划分标准，此家系提供ACMG相关的强致病性证据。
其余家系的计算（来自Bayrak-Toydemir et al, 2008）
原文中提到的三个家系的资料来自于Bayrak-Toydemir et al, 2008，并未对该文献中的其他家系进行计算，这里作者按照本方法列出计算结果以供参考：
家系1
患者组N值：（1/2）^7【II2和II5的基因型可以通过其相应后代的基因型推测得到】
正常足N值：[1-（1/2）^1]*[1-（1/2）^1]（分别对应IV2和II6）
总N值：（1/2）^9=1/512
原文BF值为：461.58
对比：结果接近。
家系2
患者组N值：（1/2）^3
正常组N值：[1-（1/2）^1]*[1-（1/2）^2][B9]【分别对应IV2和II3，IV2提供的N值为1-1/2，II3提供的N值为1-1/2*1/2（即1-II2和II3都携带有待判读变异的可能性）】
总N值：（1/2）^4*3/4=3/64≈21.3
原文BF值：19.31
对比：结果接近
家系5
患者组N值：（1/2）^6【II1和II3的基因型可以通过其相应的后代的基因型推测得到】
正常组N值：1-（1/2）^1=1/2【对应III5不携带待判读变异的可能性】
总N值：（1/2）^7=1/128
原文BF值：121.35
对比：结果相近
家系6
患者组N值：（1/2）^6【II2和II6的基因型可以通过其后代的基因型推测得到】
总N值：（1/2）^6=1/64
原文BF值：31.82
对比：相差较大（原因未名）
家系7
患者组N值（总N值）：（1/2）^3=1/8
原文BF值：7.98
对比：结果接近
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