做完甲基化测序后（当然不止是甲基化测序，也适用于其他测序）需要对分析结果中感兴趣的基因进行生物学功能验证，包括分子实验、病毒包装、细胞水平验证、动物水平验证等。
基因验证
分子实验：质粒构建（普通基因、microRNA、lncRNA、Cas9、点突变、启动子）等。
病毒包装：慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒
细胞水平：稳定株构建、蛋白与蛋白互作（BioID、GST pull down）、细胞表型实验（周期检测、凋亡检测、克隆形成、侵袭、迁移）、靶基因验证等
动物水平：皮下成瘤、转基因鼠、活体成像、免疫组化、免疫荧光、HE染色等
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客户案例
摘要：
近年来，RNA水平的表观遗传修饰因其重要的病理生理功能越来越受到研究人员的重视。其中RNA的甲基化(m6A，N6-methyl-adenosine)修饰作为转录后修饰的一种成为最重要的研究靶点。但是RNA的甲基化修饰对于癌症特别是肝癌的发生发展及作用目前还不是很清楚。
孙树汉课题组在男女各20例肝癌样本中利用q-PCR的方法检测目前已知的RNA甲基化酶和去甲基化酶的表达，发现RNA甲基转移酶METTL14在肝癌中显著下调。干扰METTL14后，利用dot blot和Northern blot方法，发现整体RNA甲基化水平也明显降低。通过细胞功能学实验发现，下调表达的METTL14能够促进细胞凋亡、抑制细胞增殖、抑制细胞周期进程。在干扰METTL14的细胞系中，p21及其他细胞周期相关基因出现差异表达，并且这些基因包含有数据库中的RNA甲基化位点。
在寻找影响METTL14表达的因素时，IL1β能够明显下调METTL14的表达。结果表明METTL14在肝癌中下调表达并且可能通过RNA甲基化修饰影响细胞周期相关蛋白的表达从而抑制细胞周期进程，METTL14以及RNA甲基化修饰对于肝癌的发展具有重要的作用。慢病毒由和元上海提供。
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1. 原发性肝细胞癌HCC中存在m6A修饰异常
作者首先使用酶标仪对肝癌组织、癌旁组织以及正常组织中m6A的整体水平进行了检测，试剂盒（The m6A RNA methylation quantification kit, Abcam）原理与ELISA相似。同样，去除rRNA后，m6A水平也显著降低。结果表明，在HCC中无论是mRNA还是rRNA，整体m6A水平显著降低。
2. METTL14引起HCC中m6A水平异常
下一步，作者对几种常见的甲基化转移酶和去甲基化酶进行了qPCR验证，发现METTL14和FTO这两个基因在HCC中表达量显著降低。接下来，作者又对130个HCC队列病人的肝癌组织和癌旁组织进行了验证发现基本符合趋势。另外，FTO与METTL14也具有相关性，相关系数R2=0.4789。
接下来，作者对FTO和METTL14做了细胞定位后发现，两种蛋白都位于细胞核中，但是两者并不互作。敲低和过表达METTL14后，FTO表达量并没有受到显著影响。作者推测FTO在HCC中显著降低可能是由于METTL14引起的m6A水平降低后的feedback。
下一步，作者研究了甲基化转移酶复合物的另一种蛋白METTL3后发现，METTL3会导致HCC细胞侵袭能力增强。但是在HCC病人中，METTL3的表达水平却有所降低。这个结果表明METTL3在HCC中复杂的调控机制。
作者使用siRNA对SMMC-7221细胞和hep3B细胞进行METTL14敲低。斑点杂交结果表明m6A整体水平下降。对METTL14敲除的细胞进行METTL14过表达补救后发现m6A水平恢复正常。
所以作者认为HCC中m6A修饰水平异常的主要因素之一便是METTL14。
3. METTL14下调引起肝癌转移
METTL14的水平随着肝炎、肝硬化以及HCC逐渐显著降低，这表明METTL14与HCC的恶性转化相关。针对130人HCC队列研究表明，METTL14表达量降低更易引起高频复发且生存周期降低。
后续分析表明，METTL14不仅与HCC的分化及肿瘤周期相关，还与肿瘤微卫星、微血管转移（microvascular invasion）等相关。HCC转移首先会引起门静脉癌栓（PVTT），作者在PVTT、转移瘤HCC和非转移瘤HCC中检测了METTL14的表达水平后发现，PVTT中METTL14表达量显著降低且转移瘤中m6A水平低于非转移瘤。这表明METTL14还与HCC的转移相关。
作者在其他几种肿瘤中也对METTL14水平进行了检测。结果表明METTL14在乳腺癌中表达水平显著降低，且生存周期降低。作者推测METTL14可能与乳腺癌转移在功能上相似。
另外，METTL14在HCC中显著降低也与性别、乙肝病毒抗原以及微血管转移相关，METTL14与病人生存周期相关。METTL14作为潜在的预后marker与HCC的转移相关。
4. METTL14敲除导致HCC转移能力增强
作者在SMMC-7221细胞和Hep3B细胞中进行了METTL14 siRNA干扰。结果在METTL14敲除后，这些细胞的迁移（migration）和侵染（invasiveness）显著增强。划痕实验表明也表明METTL14作为一种负调控蛋白与HCC转移相关。
下一步作者构建了METTL14敲除的稳定细胞株（带荧光报告基因）并将其注射进肝癌转移模型鼠后发现，METTL14缺失能够促进肿瘤生长，并在肝脏内发现更为恶化的转移现象。最后，作者还在发生肺癌转移的小鼠模型中注射METTL14缺失的SMMC-7221细胞，并发现METTL14缺失会导致肺癌转移恶化。
5. 过表达METTL14在HCC中抑制肿瘤侵袭和转移
与上一个实验相反的是，作者在这里对METTL14进行过表达后进行一系列细胞表型实验。下一步构建了METTL14稳定细胞株后注射进肿瘤模型鼠中。无论是细胞实验还是动物模型实验，METTL14过表达都会显著降低肿瘤侵袭和转移水平。
6. METTL14介导m6A修饰通过与DGCR8互作调控miR-126加工
先前已有报道称，DGCR8与METTL3互作，METTL3敲低会影响miRNA成熟的加工，显著增加pri-miRNA的表达量。在本实验中，作者对METTL14进行了IP实验后发现，METTL14与DGCR8互作且由RNA介导。METTL14敲除或敲低显著影响miRNA成熟体的表达水平，pri-miRNA表达水平上升。这些数据与已发布的miRNA芯片数据相符合。
作者找到了关键的miR-126成熟体显著降低。已知miR-126能够抑制HCC转移，这个现象在METTL14缺陷的细胞中通过miR-126 mimics进行表型补救。
在44对肝癌病人中对miR-126进行了qPCR验证后发现，HCC中miR-126表达量显著降低。此外，METTL14表达量还与miR-126相关，R2=0.439。
在HCC中，miR-126成熟体加工由甲基化转移酶METTL14介导，miR-126成熟体表达量降低会引起HCC转移。
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