一文读懂凋亡执行蛋白Caspase家族那些事

背景介绍

尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱氨酸蛋白酶在凋亡执行过程中起着至关重要的作用，而且细胞凋亡的过程实际上是Caspase被活化并发生凋亡蛋白酶的级联反应，Caspase家族蛋白存在于胞浆中，它们同源性很高，结构相似，均含有一个半胱氨酸激活位点，特异地断开天冬氨酸残基后的肽键，目前被发现的Caspases有14种，它们参与调节多种生物学过程，与细胞凋亡密切相关，此外还参与细胞的生长、分化、增殖和运动。

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Caspases家族

哺乳动物Caspase家族蛋白根据结构和功能，可以分为三大类（图1）：

第一类：促凋亡Caspases

主要包括Caspase-2，8，9，10，3，6，7。它们以级联放大的方式对胞内蛋白进行高效切割，最终导致细胞凋亡。它们被分为两派，其中Caspase 2，8，9，10参与细胞凋亡的起始（启动者，initiators）;Caspase 3，6，7参与细胞凋亡执行（效应者，effectors）。

第二类：促炎性Caspases

主要包括Caspase-1，4，5，11，12，13。在先天性免疫应答激活期间，促炎性Caspases介导特异性细胞因子（cytokines）的成熟，如Pro-IL-1β和Pro-IL-18，形成有活性的IL-1β和IL-18；但也可能参与一种称为pyroptosis（焦亡）的细胞死亡形式。

第三类：角化细胞分化

图1：Caspase家族图谱。图片来源于网络

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Caspases活化

细胞中合成的Caspases以无活性的酶原状态存在，经过活化后方能执行剪切功能。Caspase的活化是有顺序的多步水解的过程，Caspase分子各异，但是它们活化的过程相似。需在两个亚基的连接区的天冬氨酸位点进行切割，结果产生了由两个亚基组成的异二聚体，再由两个二聚体形成有活性的四聚体。通常N-末端的肽在活化时也被除去，但对于Caspase-9是否去除N-末端肽对活性无影响。

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凋亡执行

Caspase 3和7具有相近的底物和抑制剂特异性，它们异源活化后降解PARP，DFF-45(DNA fragmentation factor-45)，导致DNA修复的抑制并启动DNA的降解。而Caspase-6的底物是lamin A（详情请点击往期推文：爆款产品-明星分子Lamin A/C重组兔单抗）和keratin 18，它们的降解导致核纤层和细胞骨架的崩解。

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细胞凋亡的检测方法

细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞死亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。

细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。

方法一：形态学检测

以显微镜观察细胞甚至是亚细胞层面的形态变化和形态学特征，而具体的显微镜技术以及其所检测的凋亡形态学特征见下图（图2）：

图2：显微镜技术及其检测的凋亡相关形态学特征。图片来源于网络

方法二：流式细胞术检测（FCM,  Annexin V-PI双染色实验）

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布于细胞膜磷脂双分子层内侧，细胞处于凋亡早期时，PS发生外翻出现在细胞外侧，Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，可与PS高度亲和，因而Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡晚期和死细胞中，PI可透过细胞膜与细胞核结合。Annexin V和PI配合使用，可以将凋亡早期细胞和晚期细胞以及死细胞区分开来。

Annexin V-PI双染实验可将细胞分为四种类型（图3）

图3：Annexin V-PI双染色实验

B3象限：Annexin V阴性且PI阴性（双阴性细胞）：活细胞；

B4象限：Annexin V阳性且PI阴性：早期凋亡细胞；

B2象限：Annexin V阳性且PI阳性（双阳性细胞）：晚期凋亡细胞；

B1象限：Annexin V阴性且PI阳性：坏死细胞。

3.核酸电泳检测（DNA片段检测法）

细胞凋亡时DNA会发生片段化，形成200bp的整数倍；而坏死细胞时DNA发生无规则断裂。因而在凝胶电泳中，如果出现这种显著特征的电泳条带，就可以判断细胞发生了凋亡。

图4：DNA片段凝胶电泳

4. mRNA水平的检测

科学家们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（Cytotoxic T cells）等靶细胞。Bcl-2 和Bcl-xL作为抗凋亡的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。因而可以用qPCR技术（详情请点击往期推文：新款通用型qPCR mix，专治各种不服 & 新品上市--Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix）来检测Fas, Bax 和 Bcl-xL基因的 mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

5. 细胞色素C的定位检测

细胞色素C（Cytochrome C）作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆，结合Apaf-1（Apoptotic protease activating factor-1）后启动Caspase级联反应。因而可以通过组化或荧光方法检测Cytochrome C定位来判断细胞凋亡。

6. 凋亡明星分子检测

通常以Western Blot检测凋亡通路明星蛋白，如Caspase家族蛋白，Caspase 8，Caspase 6，和Caspase 3的前体和剪接体，以及Caspase 3的底物PARP分子；又如Bcl-2家族蛋白，抑制凋亡的Bcl-2和促进凋亡的Bax，在以Western Blot检测Bcl-2和Bax的表达量后，通过Bcl-2/Bax的比值，可表征细胞凋亡的程度。

图5：ABclonal第四代重组兔单抗制备流程