通常全基因组甲基化分析作为一种高通量的筛选发现目标基因的手段，常见的技术包括850K芯片，安捷伦捕获测序，MeDIP-seq，RRBS，WGBS等。特异位点甲基化检测一般在作为一种后期的技术验证手段，常见的技术包括：MSP、BSP、焦磷酸测序以及质谱检测。特异性位点的甲基化验证技术各有不同，我们又该如何选择呢？今天小编将为大家介绍MSP、BSP、焦磷酸测序以及质谱甲基化检测技术的优缺点，以便于大家根据自己的实验需求选择合适的验证技术。
Prosequencing(焦磷酸测序)
焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）：是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦磷酸测序法适于对已知的短序列（<50bp）的测序分析，主要包括甲基化位点和单核苷酸多态性的定量检测。随着技术的不断改进，现在认为焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）是甲基化检测新的金标准。序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T 比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测，并给出精确的甲基化程度的数据。QIAGEN公司在焦磷酸测序的应用上具有明显的优势，目前提供三种焦磷酸测序仪器，通量由低到高，适合不同的应用。PyroMark Q24 的强项在于可对多达24个样品进行焦磷酸测序。需要大样品量的应用更适合在PyroMark Q96 ID 上进行。在考虑到处理成百上千个样品所需的大量试剂时，运行通量最大化可能会使实验成本变得很高。而PyroMark Q96 MD装有一台高度灵敏的光检测摄像头，可以在减少试剂量的情况下对少量的DNA模板进行准确测序。这些不同平台的推出，对于我们实际研究提供了更有效的检测手段。
虽然焦磷酸测序可以进行单个位点甲基化程度的精确定量，但是目前来看，测序的片段长度还比较短，有效长度约为60bp。
横坐标：依次加入的dNTP；
纵坐标：相对荧光强度；
百分比：目的位点的甲基化频率；
每个峰的高度代表该种dNTP的掺入情况，峰高与掺入的核苷酸数量成正比；
黄色柱状：判定亚硫酸盐转化是否完全。
MSP
Herman等1996年在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。它将DNA先用重亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，随后行引物特异性的PCR。MS-PCR中设计两对引物，并要求：1.引物末端均设计至检测位点结束;2.两对引物分别只能与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即一对结合处理后的甲基化DNA链，另一对结合处理后的非甲基化DNA链。检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化;若用针对处理后的非甲基化DNA链的引物扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化 。DNA经重亚硫酸盐处理后，以处理后的产物作为模板，加入甲基化特异性的引物(primerⅠ)或非甲基化的引物(primerⅡ)，进行特异性的扩增，只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物。
BSP
直接测序是由Frommer等提出的研究DNA甲基化方法过程是：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后,对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化。
这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，设计引物进行PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行克隆测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。
质谱（MALDI-TOF MS技术）
碱基特异性酶切（MassCLEAVE）实验首先需用亚硫酸盐处理 DNA，经过处理后 DNA 中的未甲基化的胞嘧啶 (C) 转变为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶则保持不变。然后利用 5' 末端带有 T7- 启动子的引物进行 PCR 扩增，扩增产物经 SAP( 虾碱性磷酸酶 ) 处理后再进行碱基特异性的酶切反应。酶切后 基因组 DNA 片段的大小和分子量取决于亚硫酸盐处理后的碱基变化，结果使含与不含 CpG 位点的片段的质量相差 16Da，飞行质谱仪器则能测出每个片段的分子量，EpiTYPER 则能自动报每个相应片段的具体甲基化数。
现在我们再通过1张表来具体的认识各技术之间的特点和优劣势。
综上所述，不同的技术都有其各自的优劣势，应结合自身需求选择适合的检测技术。
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