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基本原理
CRISPR-Cas9是一种细菌获得性免疫,用于降解入侵的外源DNA。CRISPR RNA (crRNA) 与转录激活crRNA (Trans-activating crRNA, tracrRNA) 退火形成的复合物能特异性识别与其互补的基因组序列,引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂,如下图所示。
因此本实验的关键步骤是设计一对20bp(不包括NGG在内的)完全互补的oligo插入到如上图所示的filler。另U6启动子需要5’端的G起始转录,因此若设计的oligo第一个碱基非G,需额外增加一个G。
操作详细流程
关于sgRNA的设计我们有专门开过一篇文章《一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析》[点击此处阅读]
确定靶基因的序列,可通过在线网站设计(http://tools.genome-engineering.org ),或根据靶基因的CDS序列自行设计,最方便的是在human KO Library sgRNA里选择。无论选择哪种方式,都建议进行一下blast。
附上在线设计网页截图。输入基因的name,填写email address,设计结果稍后会发送到此邮箱,选择序列的类型以及物种。如sequence type选择unique region,一次只能输入23~500bp的基因片段,最好一次只输入一个外显子,避免guide序列跨越内含子,都选择键入后点击提交,关注邮箱或者在线等。
分析中,显示你所键入的基因序列里有36对可选的guide序列。
大片段约11kb 回收;小片段约2kb为切下来的filler,不要。
室温连接4-6 h。
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