检验技术资格考试考点精要——微生物学检验(中级)
1. 生物学按界门纲目科属种分类，种是最小单位。病毒分类:目、科、亚科、属、种。属名--VRirus结尾的单词,亚科名--VRirinae结尾的单词,科名--VRiridae结尾的单词。目名—VRirales。2004年ICTV公布病毒分为:73个科、11个亚种、289个属。
2. 结核菌可利用甘油为碳源，梭状芽胞菌可以氨基酸为碳源，流感嗜血杆菌要?，?因子才能生长。
3. 药物敏感试验:纸碟法、小杯法、凹孔法、试管法。常用单片纸碟法、试管稀释法(以抗菌药物的最高稀释度仍能抑制细菌生长或杀菌管为终点，该管含药浓度为最低抑菌浓度MIC或最低杀菌浓度MBC)，两值越低则表示越敏感。MIC与抑菌圈呈负相关，即抑菌环直径越大，MIC越小。
各药敏纸片间距不少于24mm，距平板内缘不小于15mm。
药物敏感实验判定标准 :抑菌圈直径(毫米):20以上极敏、15~20高敏、10~14中敏、10以下低敏。不同的菌株、不同的抗生素纸片需参照NCCLs的标准或者CLSI标准。
多黏菌素抑菌圈;在9毫米以上为高敏，6—9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。
4.常用的免疫技术:酶免疫技术(EIA)、协同凝集试验、免疫荧光技术(IF)、对流免疫电泳(CIE)、免疫印迹技术。
5.病原菌核酸的检测:核酸杂交、PCR技术、基因芯片技术。
PCR技术—是选择DNA或RNA体外扩增技术，用标本提取DNA为扩增模板，选用一对特异寡核苷酸为引物，PCR一般要经历三十多次循环，经不同温度变性93-94?(作用1min氢键断裂形成单链DNA)、退火40-60?(迅速冷却30-60s引物与DNA模板结合，形成局部双链)、延伸70-75?(在TaqDNA聚合酶作用下，以A、T、G、C四种脱氧核苷酸为原料，从引物5’?3’端延伸，合成与模板互补的DNA链。)，扩增产物用溴乙啶染色的凝胶电泳。其具有特异、快速、灵敏、特异性强、操作简便、能够定量。引物是PCR特异性的决定因素，PCR反应中TaqDNA聚合酶、引物加量过多，可引起非靶序列扩增。
变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变: 1)溶液粘度降低。2)溶液旋光性发生改变。3)增色效应。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为' 退火'，Tm低25?左右的温度是复性的最佳条件。核酸实验中经常以迅速冷却至4?以下方式保持DNA的变性(单链)状态。
基因芯片技术(DNA芯片、DNA微阵列)—主要过程:DNA微阵列的制备、样品的制备、靶分子和探针之间的杂交、杂交信号的检测与分析。具有快速、敏感、高通量检测平台。
核酸杂交(基因探针杂交技术)--是指单链RNA和DNA或DNA和DNA或RNA和RNA，根据碱基配对原则，借氢键相连而形成杂交分子的过程。杂交百分率,70%(?69%)为高度同源性，同源性在60%以上是一个种，同源性在60%--70%是同一种内不同亚种，同源性在20%--60%同一属内不同菌种，同源性
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20%?不同属的菌种。
AFLP的含义是----扩增片段长度多态性。有很大功能的DNA指纹技术。一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。
6.细菌诊断流程有:双岐索引法，表解法，数字编码鉴定法。致病性岛:由基因编码决定的一团与致病性相关的基因组。
7. 病原细菌确定原则:(郭霍Koch原则)1、从一种疾病病人中能有规律地发现一种细菌2、能够分离这种细菌获得纯培养3、把这种细菌的培养物引入易感动物体内，可以引起与病人类似的疾病4、在实验感染引起的疾病中仍然能够分离同一种细菌。
8. 杆菌肽用于A(敏感)与非A群链球菌的鉴定。O/129抑菌试验对弧菌有用而对气单胞菌无用。
9. 奥普托欣试验:肺炎链球菌敏感。
10. 杂交分:斑点，菌落原位，Southern(DNA)印迹，Northern(RNA，DNA)印迹。
11. L型细菌:细胞壁缺陷(形态多样，染色不定，可过滤，渗透压敏感，生化减弱等)培养应高渗透压(3-5%氯化钠、20%蔗糖)，琼脂浓度0.5以下半固体培养基。染色多为G染阴性，形态不一(巨球形是特征)，固定要用10g/L鞣酸不能用火焰。
增殖:以二分裂、出芽、巨形体释放颗粒方式。一般菌落有:油煎蛋样(L)，颗粒型(G)，丝状菌落(F)，鉴定要点:染色易变多形性，生长在增菌液中微浑，颗粒样沉淀或沿试管壁生长，返祖现象。致病特点:慢性和反复发作性感染，致病物质是毒素。L型细菌在体内体外都可形成。原生质体与原生质球都是细胞壁缺陷的细菌。
12. 细菌的突变:基因突变(又称点突变;有碱基对的置换、插入、或缺失、错码)、染色体畸变 (易位、倒位、重复、缺失)。突变:自发突变、诱发突变。质粒在细菌的自发突变中起重要作用。细菌质粒在重组DNA技术中常用的载体。质粒的分离提纯使用酚处理，用乙醇沉淀。
13.噬菌体--是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒，具有病毒的基本特性，专性胞内寄生，有严格的宿主特异性。由核酸和蛋白质组成。大多数DNA噬菌体的DNA为线状双链(有尾噬菌体的核酸);RNA噬菌体的RNA为线状单链(无尾噬菌体的核酸为环状单链DNA或线状单链RNA)。对紫外线敏感10-15分钟失去活性。噬菌体分毒性噬菌体、温和噬菌体(溶原性噬菌体);毒性噬菌体以复制方式增殖，过程吸附、穿入、生物合成、成熟与释放，少脱壳。在液体培养基中使混浊菌液变澄清，在固体培养基上形成噬斑。温和噬菌体---是噬菌体基因组整合于宿主菌染色体中，有溶原性周期、溶菌性周期。噬菌体可以根据不同细菌的表面受体来裂解目标菌---是判定某些种类病原体的重要依据。
14. 肽聚糖的结构由聚糖骨架，四肽侧链和五肽交联桥(G,无交联桥)。磷壁酸为G，特有，分壁和膜两种。外膜层由脂多糖，脂质双层，脂蛋白组成。细胞质内有核蛋白体(蛋白合成地)，核质(主
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要遗传物质)质粒，胞质颗粒，是细菌蛋白质和酶类合成的重要场所。鞭毛是由细胞质伸出的蛋白性丝状物。性菌毛仅有1,10根，毒力和耐药质粒都能通过它转移，有致病性。
15. 免疫器官:骨髓、胸腺、脾、淋巴结、扁桃体、小肠集合淋巴结、阑尾和黏膜免疫系统。免疫细胞:淋巴细胞、单核吞噬细胞、中性粒细胞、嗜酸嗜碱性粒细胞、肥大细胞、血小板。免疫分子:补体、免疫球蛋白、细胞因子
中枢免疫器官:骨髓、胸腺、鸟类法氏囊。外周免疫器官:淋巴结、脾和粘膜相关淋巴组织 特异性免疫:体液免疫、细胞免疫。
+体液免疫:(B淋巴细胞介导，CD4Th辅助，Th2细胞能分泌细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10);效应是抗体(Ab);1、病毒中和抗体(不能直接灭活病毒，IgG、IgM、IgA)2、血凝抑制抗体(HLAb)3、补体结合抗体。
IgG在体液中含量最多，分子量小是唯一能通过胎盘的抗体。IgM分子量大，是最早产生的抗体，中作早期诊断。IgA存在黏膜分泌液中，在局部可阻止病毒侵入，能抵抗蛋白酶的水解作用，具局部抗体。IgE可与肥大细胞膜上的Fc受体结合。
补体C:存在血清中，不耐热，可辅助特异性抗体介导的溶菌作用，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件。由9种成份，11种蛋白组成。补体激活两个途径:传统途径(一)---被Ag-Ab免疫复合物IC活化，顺序C1、C4、2C、3C、5C、6C、7C、8C、C9。旁路途径(二)---被细胞的脂多糖激活。补体激活---酶促级连反应。
++细胞免疫(T淋巴细胞介导，效应细胞:细胞毒性T细胞(CTL)、CD4Th1细胞、CD8毒性T细胞CTL)。Th1细胞诱导产生迟发型超敏反应(DTH)
16.测特异性抗原最常用实验:凝集试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光试验、胶体金免疫吸附试验
17. 细菌营养转运的方式有:离子，透性酶，磷酸酶。营养物质进入机体的方式:易化扩散、主动运转(由透性酶完成)、基团移位(糖类由磷酸酶磷酸化进入胞内，不能再透出菌体)。
18. 细菌生长繁殖的条件:充足的营养、适宜的温度、合适的酸碱度、必须的气体环境。细菌生长的温度极限-7--90?: 嗜冷菌最适温为10,20?，嗜温菌为20,40?，嗜热菌为50,60?。适宜的酸碱度PH7.2—7.6。细菌生长繁殖分为四期:迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期
19.(肠道杆菌)细菌的四种生化反应:吲哚(I)、甲基红(M)、VP(V)、枸橼酸盐利用(C)，合称为IMViC。大肠杆菌呈++--，产气杆菌呈--++。还需做糖发酵试验，KIA产酸产气，MIU，――，有菌体(O)荚膜(K)鞭毛(H)三抗原。肠杆菌科分型多采用苯丙氨酸脱氨酶和葡萄糖酸盐试验。可疑菌分别接种克氏双糖铁(KIA)尿素靛基质动力(MIU)来定属。
细菌代谢所需能量主要以生物氧化作用而来。细菌新陈代谢的产物:热原质、毒素与酶、色素、抗
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生素、细菌素。热原质除去的最好方法---蒸馏。内毒素(G-脂质A)、外毒素(G+产生的毒性蛋白质产物，具有抗原性强、毒性强、作用特异性强、不耐热、人工化学可脱毒性，0.4%甲醛脱毒后形成类毒素进行人工免疫)。据亲和性及作用靶点分为:神经毒素、细胞毒素、肠毒素。细菌的内毒素一般由:脂质A(主要成份)，非特异性核心多糖，菌体特异性多糖。一般7,10天后机体产生特异性免疫。IgG和IgM能在血中直接中和病毒。
热原质:脂多糖，多由G-产生，耐高温，可引起发热反应，高压蒸气灭菌(121?20分钟)使其破坏。
20. 细胞壁的作用:承受胞内高渗压、支持细胞膜、维持细菌形态;是鞭毛运动的支点。 细胞壁的主要成份:肽聚糖(又称黏肽、胞壁质)，是原核生物特有的成份，能破坏肽聚分子结构或抑制其合成的物质，都有抑菌和杀菌作用。
G-菌细胞壁的主要成份:肽聚糖、脂蛋白、外膜、脂多糖(LPS)(类脂A、核心多糖、特异性多糖)，菌体脂多糖(LPS)能引起发热故称热原质，又称为细菌的内毒素。
细胞膜的主要功能:物质纳泄、生物合成、呼吸作用、形成中介体。
细胞质中的异染颗粒主要成份:RNA、多偏磷酸盐
又能防止金属生锈。 21.有芽胞破伤风菌需沸水煮3h才杀死。水中加入2%碳酸钠能将沸点提到105?
22. 紫外线波长265,266nm时杀菌力最强。日光灯波长约0.5µm。
23. 滤菌器用于除菌的孔径是0.22µm，另外以石棉板为滤板的金属滤器称Seitz滤器(蔡氏滤器)按滤孔大小分K:最大，澄清用，EK-S最小，可阻止大病毒通过EK:居中，除去一般细菌。玻璃滤菌器分G1,G6，G5，G6两型能阻止细菌通过。
24. 高压灭菌指示物:嗜热脂肪芽胞杆菌(ATCC 7053)，紫外线杀菌指示物:枯草芽胞杆菌黑色变种(ATCC 9372)。
25. 细菌遗传物质主要在于染色体、质粒和转位因子中。质粒:不依赖染色体而复制，不相容性，转移性，指令性，大多数质粒在自然状态下是一种闭合环状双链DNA。主要有耐药质粒，Col质粒(编码肠毒素)Vi质粒(编码细菌与致病性有关的蛋白)。转位因子为存在于细菌染色体或质粒上的一特异的核苷酸序列可在DNA中移动，主要有三类:插入顺序(最小的转位因子)，转座子，转座噬菌体。 质粒载体具有特点:复制起点、抗菌素抗性基因、多种限制酶的单一切点、较高的拷贝数
26.病毒的特性:1、只含一种核酸2、基因组复制3、缺乏完整的酶系统4、RNA病毒的RNA经反转录合成互补DNA(CDNA)。甘油(10,)或10%二甲基亚砜的血清作悬浮细胞的液体在液氮中保存细胞，在干冰温度(-70?)和液态氮温度(-196?)下长期保存其感染性;将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率(1?,分钟)冷冻，直至—150?，再将这些小管贮存在—150,,196?的液氮中，解冻做法是:将封口的小管迅速放入37?的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养
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基。PH5-9稳定;射线和紫外线、X线、r线能灭活病毒。病毒学上常用的细胞类型:原代细胞、二倍体细胞、传代细胞。
27. 超净工作台应采用层流技术净化空气、选择垂直气流通风方式。洁净度可达百级，只保护样品。
28.菌体蛋白电离后带负电荷;而碱性染料电离时染料离子带正电。
29.染色程序及方法:制片?固定?媒染?染色?脱色?复染?水洗?干燥?镜检。
革兰染色法:初染(草酸铵结晶紫)、媒染(碘液)、脱色(95%酒精)、复染(番红)。
抗酸染色法:5%石炭酸复红、5%盐酸酒精脱色、美兰复染。
芽胞染色:菌悬液?孔雀绿?水浴15-20分钟?涂片?干燥?固定?水洗脱色?番红或稀释石炭酸复红复染?水洗?晾干
荚膜染色:(负染色法、墨水法)。负染色法:制片(蒸馏水+菌)?干燥(晾干)?染色(复红)?水洗?干燥(晾干)?涂墨素。背景灰色、菌体红色、荚膜无色透明
鞭毛染色---镀银法;媒染A液—10%单宁酸10ml+5ml饱和硫酸钾铝水溶液+1ml苯胺饱和水溶液+5%
5%硝酸银+浓氨水(比重0.88)成薄雾状。 氯化铁水溶液成墨色。银染B液—
制片(蒸馏水+菌)?干燥(晾干)?染色(A液3—5分钟)?水洗?干燥(晾干)?染色(B液稍加热分30—60秒)?水洗?干燥(晾干)。菌体深褐色、鞭毛褐色。
30.病毒吸附蛋白(VAP);血凝素(HAs)。病毒的复制周期:吸附、穿入、脱壳、生物合成及组装、成熟和释放
31.病毒突变株分:条件致死性突变株，空斑和宿主依赖性。遗传型变异机制有突变，基因转移，重组。突变:突变率由复制的准确度，DNA发生损伤的机会，及对损伤DNA修复程度来决定。
32.非特异性免疫:干扰素(IFN)、NK细胞 。干扰素(IFN)--具有广谱抗病毒作用，只能抑制病毒，即通过诱导细胞合成抗病毒蛋白(AVP)发挥效应。
33.小淋巴细胞分为:T细胞、B细胞、K细胞。T细胞来自骨髓，在胸腺成熟。在人体血液中T细胞占淋巴细胞总数的60—70%，;在胸导管则占95%以上。B细胞第一个合成产物是u链。
34.碱基的置换:嘌呤换嘌呤，嘧啶换嘧啶为转换，嘌呤换嘧啶为颠换。影响基因表达的因素有:调控部位，调节蛋白，效应分子。
35.转化:受体菌直接摄取供体菌提供的游离DNA片段，整合重组(与染色体重组)使受体菌的性状发生变异。一般有链，嗜血，芽胞菌有此功能。
36. G，菌等电点pI=2,3，G,菌等电点pI=4,5。RNA主要存在于细胞质中占细菌干重的10%，DNA存在于染色体和质粒中。G+菌的感受态是由感受态因子(CF)的胞外信号诱导的。
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