照例最先展示下最后的成果图（其实最后可以用Graphpad做图，在此不赘述）：
好了，开始今天的课程，现在手里有张这样的WB条带图， 如何将各条带灰度值测量出来？
首先我们从基本原理聊起，图片大小的存储基本单位是字节，每个字节是有8个比特（bit，音译为比特，也称为“位”）组成。一般的图片都是由众多像素点构成的，灰度模式下一个像素一个字节，也同时就是8bit。在上一堂课中，我们曾用Image J将图片转化为灰度图，就是通过image→type→8-bit这一步。如果把黑-灰-白连续变化的灰度值量化为256个灰度级，灰度值的范围也就为0-255，表示亮度由深到浅。
从上图我们可以得知纯黑为0，纯白为255，中间0-255代表各个不同亮度等级。
而通常我们所得到的WB图片是这样的：
前者A是没有转化为灰度模式的，后者B是灰度模式下的。而在灰度模式下，如果按灰度值描述的话，显然有明显条带的的灰度数据基本都与0相近，数值很小，这样不利于互相比较。所以通常的做法是进行“反相”，也就是将白的地方变为黑，黑的地方变为白，颜色颠倒。也就是这样：
至此条带上的灰度值就成了越亮越白则灰度值越大（有没有小伙伴看过那种原始照片底片，记不记得底片上人物的头发都是白的发亮，这种就是灰度值255哦；还有做电泳凝胶的小伙伴，得到的凝胶图就不需要反相了，可以直接进行灰度值分析哦）。我们目前要想测量条带的灰度值，就只需把那发光发亮的地方圈出来，读取灰度值就可以了，而这一部分就交给photoshop来计算吧。
在这里小石头想敲敲黑板，提醒大家注意下三点：
1、由于Photoshop得出的灰度值是平均灰度值，而在比较WB条带灰度值时，我们还应考虑面积的关系，以面积与平均灰度相乘得出的总灰度，我们才能更准确地得出条带之间的表达差异。
2、条带上得出的数据其实是相对于背景而言的，这个背景虽然反相之后非常黑了，但毕竟不是全黑的，我们还需要扣除背景的灰度值。并且，背景尽量干净，这就要求我们在做WB时多努力了。
3、不同图片的背景是不一样的，不同图片的WB条带是不能进行相互比较的哦。
接下来附上Photoshop测量WB条带的灰度值的操作方法，其中每一步的意义基本已在上文所介绍，对哪一步操作有不明白的小伙伴可以回过头再看看的。
步骤1：打开软件Photoshop→左上角打开图片
步骤2:将图片转为灰度模式（如果已经为灰度，此步跳过）：图像→模式→灰度→扔掉
步骤3:将条带摆正（两种方法）
通用步骤：最左侧选取标尺工具→在条带上画一条自认本应水平的线
方法一：直接点击正上方“拉直图层”（此操作简便，但有可能使边缘条带挪出界外）
方法二：图像→图像旋转→任意角度→确定
步骤4:得到的灰度图进行适当调整：图像→调整→色阶→调整下图中三个点，适当将自己的WB图片转成黑白对比稍明显的样子，如图（此步也可通过更改亮度/对比度实现:图像→调整→亮度/对比度）
步骤5：反相：图像→调整→反相
步骤6：最左侧多边形套索工具→延条带边缘圈选→图像→分析→记录测量（分析→选择数据点可以只显灰度值-平均值和面积），依此步依次测量各个条带，同样的方法选取任意一个背景测量背景灰度值。
步骤7：导出数据，进行处理
结语：也许有小伙伴会提出这样测出的灰度值存在差异，在此提出的解决方案是可以与内参进行比较取相对值，或者多次独立测量以及实验。而对WB条带量化，可以参照上堂课用Image J软件，今天主要还是讲述Photoshop与灰度值。谢谢小伙伴们辛苦看到这里了，不知小石头讲清楚了么，其实测量灰度还有很多方法操作，但原理通，万法通，希望对大家有帮助，大家下期再见。
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