信使RNA翻译成前体蛋白之后,还可以进行各种各样的修饰,增加其功能的多样性。
我们以组蛋白H3为例,来说明不同的修饰类型和修饰位点可以发挥不同的功能。H3K4me3修饰发挥的是转录激活的作用,而H3K27me3发挥的却是转录抑制的作用。
一篇好的蛋白翻译后修饰的文章可以发表在CNS的主刊也并不为奇,CNS的子刊里蛋白翻译后修饰的文章更是遍地开花。但要达到一定的高度,并不是一两句话可以说清楚道明白的。所以我们今天只讲初级策略。
以这篇发表在NATURE COMMUNICATIONS (IF=12) 上的文章:CaMKII-mediated Beclin 1 phosphorylation regulates autophagy that promotes degradation of Id and neuroblastoma cell differentiation 来说明。
第一步:首先要确定你要研究的蛋白。
功能上越重要的蛋白研究的意义就越大,但是功能上非常重要的那些蛋白,研究得已经非常多了,所以你得确定你想要研究的东西,目前还没有被研究。这篇文章要研究的是Beclin 1蛋白的磷酸化。
Question 1: Beclin 1蛋白被哪个激酶磷酸化?
寻找激酶,我们有这么几种方法。
1、利用Scansite进行蛋白质磷酸化预测,网址:https://scansite4.mit.edu/4.0/#home
2、Human Protein Reference Database,网址http://www.hprd.org/
3、在CST官网的最上方有一个工具,叫phosphosite,这个也可以预测磷酸化位点;
4、有一些磷酸化预测的小工具,如GPS (Group-based Prediction System v3.0)等。
经历过大概这几种方法找到这个可能的激酶后,如果能验证一下这个激酶刚好与我的底物蛋白有结合,那么此激酶可以磷酸化该底物蛋白的可能性就非常大了。
Question 2: 怎么预测这个激酶和我的底物蛋白结合方式?
1、STRING数据库,这是比较经典的蛋白互作数据库,数据库使用非常简单。
网址:https://string-db.org/
2、inBio Map数据库,可以在线使用也可以离线安装使用,根据个人的喜好。
网址:https://www.intomics.com/inbio/map.html#search
完成了以上几步之后FIG 1A的图就可以做出来,这时候大家都喜欢给这段发生磷酸化的片段做个序列保守型分析,也就是Fig1b。
第二步:实验验证磷酸化
有了以上的数据分析,我们的心里大概是有点底了,这时候就要进行实验验证了。
1、在细胞内验证磷酸化的存在;
2、体外激酶实验确定磷酸化的存在;
3、体外激酶后,用磷酸化质谱确认磷酸化位点;
4、定制该磷酸化位点的抗体,用该抗体检测其在细胞中根据处理条件的变化而变化的磷酸化水平。
5、敲低或者过表达激酶,或者使用该激酶的抑制剂,观察底物磷酸化的情况,进一步说明激酶跟底物之间的磷酸化关系。
第三步:验证相互作用关系——是否有结合
1、经典的验证结合的实验:CO-IP, 免疫荧光共定位
2、进行质粒分段,明确具体的结合区域。
第四步:激酶跟底物蛋白发生相互作用后,也就是磷酸化后有什么功能。
这是重头戏,功能的强大与否就决定了你文章的水平了。这些功能一般是:促进肿瘤生长,增殖,转移;或者是诱导底物蛋白的出核入核;又或者是影响底物蛋白的稳定性等等。
在这篇文章里,Beclin 1 在自噬的过程中是发挥了很重要的作用的,所以最后研究的重点转移到了自噬上去。跟自噬密切相关的蛋白翻译后修饰是泛素化。泛素分子的分子量较磷酸分子的分子量要大得多,有7KD,并且多是链状,所以泛素化的图是这样的——条带涂布状。
顺便给大家介绍几种泛素化预测的方法:
1、UBPred数据库,网址:http://www.ubpred.org/
2、NetChop数据库,
网址:http://www.cbs.dtu.dk/services/NetChop/
泛素化的E3酶的预测就没有磷酸化激酶预测那么直接了,一般需要用筛选的方法来进行,常见的E3酶不算多,建立一个小型的E3酶siRNA库,就可以找到自己需要的E3酶了。
泛素化的研究常常需要鉴定泛素化的类型,泛素化一共有7个不同位点的修饰,K6 K11 K27 K29 K33 K48 K63,建立这些不同位点突变的泛素分子的质粒,与底物蛋白共转之后,可以根据泛素水平的变化判断修饰类型,最常见的是K48和K63型。
第五步:动物实验和(或)免疫组化之类
为了进一步升华我们的文章,我们需要在动物身上或者是病人标本身上验证我们所研究的东西。这时候就要根据我们第四步得到的功能来进行实验设计了。
注意:这些实验往往需要在不同的细胞株中进行验证,全篇只在一个细胞株中做是不够的。稳定株中的实验更能说明问题,瞬转实验说明机制的同时,要好好利用稳转株做实验的优势。
简单的套路已经给大家介绍完了,还是有很多细节的问题是值得去考虑的,关于升华就要靠大家自己去体会了。嗯,做完这个简单的套路,大概就有12分了。
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