2021年3月24日，中国国家药品监督管理局（NMPA）通过优先审评审批，附条件批准普吉华®（普拉替尼胶囊）作为国家一类创新药上市申请，用于既往接受过含铂化疗的转染重排（RET）基因融合阳性的局部晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）成人患者的治疗。
这标志着中国有了第一个选择性RET抑制剂。
要想深入地了解RET基因和普拉替尼，咱们还得从RET基因的发现过程以及相关药物的研发历程说起。
1985年，哈佛大学医学院丹娜法伯癌症研究院（Dana-Farber Cancer Institute）的三位科学家，在实验室中发现了一个通过基因重排促进癌症发展的癌基因——RET [1]。两年之后，科学家在甲状腺乳头状癌（PTC）中首次证实RET融合存在于人类癌组织中[2]。
在随后的20多年里，科学家解析了RET激酶的结构，还发现RET融合以不依赖于配体的形式被激活，促进癌细胞的增殖和存活[3]。但这都没有引起学界对RET的关注。
直到2011年平安夜的前两天，韩国首尔大学研究团队率先破局，发表论文称他们在肺癌中发现KIF5B-RET融合[4]。
仅仅一个半月之后，日本的两个独立团队[5，6]和美国的一个研究团队[7]，在同一期《自然·医学》杂志背靠背发表三篇论文，声称他们也在肺癌中发现了RET重排。
上述四个独立研究结果的汇总
从当时报告的病例数量来看，RET融合以1-2%的比例出现在肺癌病例中 [4-7]。很快，RET就成为分子靶向治疗的一个新目标。
当时已经在其他癌种中获批，且对RET也有一定活性的多激酶抑制剂[8]（MKIs；靶点包括EGFR、MET、KIT、RET、BRAF和/或VEGFR等[3]），第一时间出现在RET融合癌症患者面前，例如vandetanib、cabozantinib、sorafenib和lenvatinib等[9-12]。
不过，与其他的肺癌靶向药物相比，RET融合非小细胞肺癌对MKIs的反应是非常令人失望的。从临床研究数据来看，这些肺癌患者接受MKIs治疗的客观反应率（ORR）在0-53%之间，中位PFS从4.7到7.3个月不等[8]。
RET的发现及治疗史
不难看出，患者亟需特异性靶向RET的药物。
好在格列卫的成功和癌症基因组学的快速发展，让癌症精准治疗的蓝图越来越清晰。在当时的情况下，据Blueprint Medicines的科学家统计：FDA批准的30种针对激酶的药物，只覆盖了人体518个激酶的5%[13]。显然，激酶抑制剂这个领域还有非常多的机会。
为了更高效地开发高选择性激酶抑制剂，Blueprint Medicines的科学家构建了专门针对激酶的化合物分子库。他们给每个化合物都制作了一个激酶树，通过这棵树，能轻而易举地看出这个化合物的抑制活性会覆盖哪些激酶。
pralsetinib、cabozantinib和vandetanib激酶活性树
据了解，目前Blueprint Medicines的分子库已经包含了20000个对激酶组树的不同激酶有抑制活性的化合物。
简单地说，在Blueprint Medicines的分子库里，每个化合物都有清晰的注释。通过这种方式，不仅能找到对野生型（WT）RET和致癌RET变体（M918T、V804L、V804M）具有抑制活性的化合物，同时还能兼顾对其他激酶保持选择性。
正是在这个专有的化合物库的支持下，Blueprint Medicines的研究人员开启了RET激酶抑制剂的研发工作。
在设计药物之前，研究人员首先分析了cabozantinib等MKIs治疗RET变异肿瘤的抑制活性和不良反应。他们发现，受体酪氨酸激酶VEGFR-2（KDR）作为MKIs的靶点，被抑制之后可导致剂量限制性毒性，如高血压、血栓形成和出血等[14]。此外，还需考虑到RET与KDR的结构高度相似[15]。因此，RET特异性抑制剂对RET的活性和选择性需比对KDR更强。
此外，在小分子药物的开发过程中，优化化合物的吸收、分布、代谢和排泄性质是非常关键的过程。接下来咱们就一起来看看普拉替尼是如何从一个骨架一步步进化成RET特异性抑制剂的。
海选骨架——寻找具有改造成RET特异性抑制潜力的化合物
基于以上这一条件，Blueprint Medicines的研究人员通过聚类分析，从自己的分子库中筛选出适合改造成RET特异性抑制剂的五个骨架分子。
聚类分析筛选分子骨架
随后从对野生型RET激酶及其突变体的活性，药代动力学，溶解度等8个方面将五个骨架分子做了比较。
五个候选化合物
从上图不难看出，骨架2和5对RET的选择性比对KDR的选择性低，二者被排除。骨架3的溶解度差，被排除。骨架4的体外肝提取率偏高，这会导致进入人体循环的药物大大减少，也被排除。因此骨架1成为最适合改造为特异性RET抑制剂的分子。
为了便于介绍药物研发过程，我们将骨架1分成了如下图所示的A、B、C、D四个部分。
骨架1的结构拆解
研究人员在动手改造骨架1之前，先研究了骨架1与RET激酶结合的特征，发现骨架1的A环靶向RET激酶的铰链（ATP结合位点），发挥抑制RET激酶活性的作用。因此，骨架1上的这个A环最好不要轻易动。
提升亲脂性——增强药物活性
为了增强骨架1的抑制活性， 又不影响发挥抑制作用的A环，研究人员首先尝试在远离A环的D环上做一些改造，以增强化合物的亲脂性，使它能进一步渗透到酶的疏水区。
这第一个改造是将原D环苯环置换为其生物电子等排体吡啶（不会显著改变化学结构，但增强其生物物理性质），并在D环上引入吡唑基团。这次改造的效果很明显，形成的化合物3在激酶水平的半数抑制浓度随之降低了26倍，在细胞水平的半数抑制浓度降低了100多倍。可以说是，大幅提高了骨架抑制激酶的活性强度及细胞水平上的活性强度。
骨架1→化合物3
但是化合物3并不完美，它的渗透性、细胞外排率和半衰期都不够理想。
改善渗透性和半衰期——延长药物作用时间
于是，研究人员又在化合物3的基础上做了三个重要改造。
用吡啶替换掉化合物3的C环，在D环苄氨基上引入甲基以减小分子的灵活性，提高其渗透性，并减小了其细胞外排率。最后，为了延长化合物3的半衰期，研究人员又在D环吡唑基团上引入氟原子，封闭化合物的代谢位点。以上的一系列改造得到了化合物5。
与化合物3相比，化合物5在渗透性、细胞外排率和半衰期（从2小时延长到7小时）三个方面均显著改善。
化合物3→化合物5
让研究人员感到惊喜的是，化合物5首次在携带RET基因变异的小鼠肿瘤模型上展现出了优异的抗肿瘤活性，完全抑制了肿瘤生长。
终于看到RET特异性抑制剂的身影了。
不过化合物5还不是终点，因为结合小鼠实验数据，研究人员预测了人体用药量，结果发现临床有效剂量为6克，且需每日两次用药（BID）。这个剂量显然还是太大了。
提高药物活性——降低用药剂量
为了降低用药剂量，研究人员设计了三个方向：改善化合物的活性强度，进行高等动物药代动力学研究，以及改善肝固有清除率。
接下来，研究人员打算围绕C环展开进一步的优化：用饱和脂环取代芳基。因为这个改造可能会提高化合物的溶解度。此外，再配以其他的修饰，以增加连接片段上的空间位阻效应，进一步实现提高活性和溶解度。
化合物5→化合物9
化合物9脱颖而出。因为化合物5的吡啶C环被变成了更灵活的饱和氮杂环哌啶，导致活性和水溶性大幅提升。遗憾的是，化合物9有两个非常显著的缺点：未结合清除率高，半衰期非常短（只有1.2小时）。
改善未结合清除率——再次降低药物代谢时间
面对半衰期的大幅缩短，研究人员首先想到的是与药物代谢密切相关的细胞色素P450。为了确定究竟是不是受到了细胞色素P450的影响，研究人员用细胞色素P450的非特异性抑制剂ABT（1-氨基苯并三唑）预处理细胞，然后再测试与化合物9结构类似的化合物10和11。
遗憾的是，ABT的预处理并没有改变10和11的清除率和半衰期。这说明氧化代谢不是此类化合物被清除的驱动因素。
如果不是氧化代谢的话，还会是哪些因素呢？
这时，化合物的电子密度出现在研究人员的脑海。因为电子密度低的化合物可以减少被氧化引入羟基的可能性，从而也就减少与体内的葡萄糖醛酸结合而排出体外的可能性。
为了确定化合物的电子密度对化合物9的影响。研究人员研究了化合物9，以及与它结构类似的化合物10、11、13和14。结果发现：不同电子密度的B环，确实会导致化合物具有不同的未结合清除率。
于是，研究人员提出一个假设：降低B环的pKa （酸度系数，反映化合物的离子化能力）可以显著改善未结合清除率。
不过B环与发挥药效的A环靠的非常近，如果大幅调整B环的结构，有可能会对A环的活性产生不利的影响。因此，研究人员想了一个折中的手段：减少对B环的电子供应，达到降低B环点子密度的目的。也就是说，继续改造C环。
因此，在A环、B环和已经改造好的D环保持不动的基础上，研究人员尝试对C环做了多种形式的修改，得到了十余个候选化合物。最终化合物9的C环从饱和氮杂环哌啶替换为反式环己烷，形成化合物16。
化合物16的药代动力学数据显示，它同时具有高活性，较好的未结合清除率和较长的半衰期。已经非常好的RET特异性抑制剂了。
最后，研究人员又做了一些优化筛选，终于得到了BLU-667（普拉替尼的曾用名）。
化合物9→BLU-667
咱们再来简单地回顾一下普拉替尼的诞生过程。
为了提升骨架的亲脂性，D环的苯环被置换为其生物电子等排体吡啶，同时在D环上引入吡唑基团，得到化合物3；为了改善渗透性、细胞外排率和半衰期，在D环苄氨基上引入甲基，同时在D环吡唑基团上引入氟原子，得到化合物5；为了进一步提高药物活性，用饱和脂环取代C环的芳基，得到化合物9；为了改善未结合清除率，把C环替换为反式环己烷，同时稍加优化，最终得到BLU-667。
（分子骨架到BLU-667全过程）
那么普拉替尼的活性究竟如何呢？
从2018年发布的临床前研究结果来看，普拉替尼在体外对致癌RET变体和抗性突变体的活性比已批准的MKIs提高了10倍以上；而普拉替尼在模式动物体内能在不抑制KDR的基础上，有效地抑制由各种RET突变和融合驱动的非小细泡肺癌和甲状腺癌的进展[14]。
也是在这一年，中国生物制药公司基石药业宣布与Blueprint Medicines达成独家合作及授权许可协议，推进普拉替尼的单药或联合治疗在中国大陆及香港、澳门和台湾地区的临床开发与商业化。
在2020年，美国食品药品监督管理局（FDA）经批准普拉替尼用于治疗转移性RET融合阳性NSCLC的成人患者、需要系统性治疗的晚期或转移性RET突变甲状腺髓样癌成人和12岁及以上儿童患者，以及需要系统性治疗且放射性碘难治（如适用）的晚期或转移性RET融合阳性甲状腺癌成人和12岁及以上儿童患者。
今年，普拉替尼正式在中国获批治疗NSCLC，国内每年新确诊的1.2万左右携带RET变异的肺癌患者终于迎来了有效的靶向治疗药物。
致谢：香港大学生物化学博士陈静，悉尼大学化学药理专业闻天煜对本文有重要贡献。
参考文献：
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[15]Brandhuber B , Haas J , Tuch B , et al. The development of LOXO-292, a potent, KDR/VEGFR2-sparing RET kinase inhibitor for treating patients with RET-dependent cancers[J]. European Journal of Cancer, 2016, 69(1):S144.
本文作者丨BioTalker
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