Transwell细胞体外侵袭实验的基本概念：
用途：研究肿瘤细胞的侵袭和转移能力。
这种方法的原理是，将细胞小室（Transwell小室）放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
优点：
1.研究某一细胞分泌产物对另一细胞迁移的影响。
2.适合研究细胞与胞外基质（ECM），细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。
3.研究药物等对细胞迁移的影响。
4.研究细胞的迁移能力。
5.研究肿瘤细胞的侵袭能力。
实验材料：
1.细胞培养板：Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔板最常用。注意，细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套；
2.基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了；
3.上层培养液：上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA。
4.下层培养液：下层常用含5%－10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS仍是最合适的。
1.制备细胞悬液
细胞饥饿12－24h，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。
2.铺细胞
24孔板下加入500ul含10%FBS或趋化因子的培养基，取细胞悬液100-200μl 加入Transwell小室，每孔10000个细胞；（注意：避免产生气泡）
3.细胞培养
4.固定
取出Transwell小室，弃去孔中培养液、用无钙的PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30分钟甚至过夜；
5.染色
0.1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。100倍显微镜下拍照；
6.拍照计数
检测穿过的细胞数有两种方法：
直接计数法
1、“贴壁”细胞计数
这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。可以通过给细胞染色，可在镜下计数细胞
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；
② 染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台靡蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。
③ 细胞计数：使用正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也有不少人用手术刀将膜切下后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存，但是这样做小室就成了一次性的了，未免有点浪费。
取若干个视野计数细胞个数。一般采用3-5个视野，也有人用10个，都是随机选取。
间接计数法
由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。
间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原理。
1、MTT法
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；
② 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 4h后取出。
③ 24孔板中加入500µl DMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10min，使甲湃充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。
2、荧光试剂检测
这类方法一般是与Transwell小室一起出售的，其原理与MTT法类似，是用一种荧光染料染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值。
3、结晶紫检测
原理与MTT法也是类似的。但结晶紫染色还有个优点，就是染色和脱色的过程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。
1.选择合适直径和孔径，一般有0.3um(用于细胞间接共培养), 4um（用于血细胞分析）,8um（用于肿瘤细胞和其他组织细胞分析））的Transwell；
2.选择合适的培养细胞时间：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞迁移侵袭能力力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视，要在。
3.细胞铺板要均匀，如果接种不均匀，后面无法用软件对图片进行细胞计数；
4.下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
5.另外，做侵袭实验需特别注意，基质胶在过高或过低的温度均易凝固，因此操作所需枪头和离心管应提前在4℃预冷；铺胶时保证液面水平，胶的厚度要均匀一致，切勿产生气泡。
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