皮肤创伤是大多数人一生中面对的最频繁的身体伤害。正常皮肤伤口愈合对生存与健康至关重要。早在史前时期，我国神农氏就发现了帮助伤口愈合的草本植物与比较原始的外科治疗方法，如压迫止血。古巴比伦王国汉谟拉比时代(约公元前1750年)，苏美尔人较早地在泥板上描述了早期的伤口护理，包括用啤酒和热水清洗伤口，以及使用酒渣和蜥蜴粪便等物质制成的膏药包扎伤口。“现代医学之父”希波克拉底(约公元前400年)详细阐明排出脓液对于伤口愈合的重要性。直到19世纪，人们才在控制感染、止血和处理坏死组织方面取得进展。
随着现代分子细胞生物学的发展，与伤口愈合相关的细胞因子和生长因子的发现开启了伤口愈合研究的新时代。特别是近几十年，人们利用多种动物模型进行皮肤伤口愈合研究，取得许多重要突破。本文主要介绍皮肤的结构功能及损伤修复的过程，重点强调不同细胞(包括上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞)在伤口愈合中的关键功能，以及无疤痕修复的潜在机制。正如希波克拉底所说：“治愈是时间问题，但有时也是机会问题。”通过伤口愈合机制的研究，不远的未来皮肤伤口修复有望得到极大改善，甚至实现皮肤无疤痕完美再生。
皮肤是人体的第一道防线，它保护机体免受紫外损伤、微生物入侵；同时，皮肤也能阻止水分流失，保护机体内脏器官。在日常生活中，我们总是受到各种机械、化学刺激或微生物侵袭，因此，皮肤损伤后的快速修复对内稳态维持至关重要。
皮肤主要由表皮(epidermis)、真皮(dermis)和皮下组织(hypodermis)构成(图1)。表皮是位于皮肤最外层的不断更新的鳞状上皮，对机体具有重要的保护作用，防止水分流失、抵抗机械压力、排除毒素及参与免疫应答[1]。表皮细胞通过自我更新维持稳态及发挥功能。基底层角质形成细胞(keratinocyte)通过增殖、分化和迁移等最终形成形态功能不同的4层，由内向外分别是：基底细胞层(stratum basale)、棘层(stratum spinosum)、颗粒层(stratum granulosum)和角质层(stratum corneum)(图1)。表皮附属器是一种特殊的表皮结构，包括毛囊、皮脂腺和汗腺。真皮与表皮间通过基底膜相连[2]。真皮层厚于表皮，富含胶原，为皮肤提供抗拉强度和机械支撑。真皮层的成纤维细胞(fibroblasts)调节纤维蛋白和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)组成，与组织损伤修复及疤痕形成密切相关。皮下组织位于真皮下方，能缓冲机械压力和储存能量。
图1 皮肤的结构与附属器官
据统计，人类有100多种皮肤遗传病以表皮分化异常为特征。干扰表皮细胞分化将严重影响皮肤屏障功能。最近，科学家们报道了多个与表皮分化相关的信号通路，包括TGF-β、Wnt、MAPK等[3]。我们小组将小鼠表皮细胞中编码RAPTOR或RICTOR(分别为构成mTORC1或mTORC2的主要蛋白)的基因敲除，发现小鼠表皮分化过程被抑制，表皮屏障功能受损[4-5]。这些研究强调mTOR信号对表皮屏障功能维持是必要的。
皮肤损伤修复是一个复杂的动态调节过程，涉及一系列细胞、细胞因子、细胞外基质在时间和空间上有序的相互作用。我们可以将皮肤损伤修复过程人为分成部分重叠的4个阶段，即血液凝固期、炎症期、增殖期和组织重构期(图2)。损伤愈合过程中的一个或多个阶段失调将导致慢性不愈合伤口或病理性疤痕形成。以下将分别介绍上述损伤修复的过程。
图2 损伤修复3个典型的阶段的示意图：(a)炎症期；(b)增殖期；(c)组织重构期
皮肤损伤后，血液从流动状态变为胶冻状半凝固状态的过程即为血液凝固期。血管损伤促进血小板激活并聚集，血小板与纤维蛋白(fibrin)结合形成纤维蛋白凝块(fibrin clot)，引起血液凝固，抑制局部出血。一般情况下，损伤后12～24 h纤维蛋白凝块即可充满损伤部位，为生长因子结合和细胞爬行(cell crawl)提供临时基质[6]，同时也为伤口提供封闭的环境，防止机体失水及病原微生物入侵。此外，激活的血小板可通过脱颗粒释放多种细胞因子，如PDGF、CXCL4、TGF-β、IGF等[7]，促进后续损伤修复过程。
伤口愈合过程中的炎症反应是一系列免疫细胞在时间和空间上有序作用的结果[8]。组织损伤数分钟内免疫细胞迅速浸润伤口，其中中性粒细胞和巨噬细胞是炎症期最主要的效应细胞。这些免疫细胞释放多种细胞因子和趋化因子，招募血液及损伤边缘的细胞进入伤口局部；同时，分泌的细胞因子也能进一步促进损伤部位细胞增殖。此外，免疫细胞分泌多种蛋白酶及活性氧(reactive oxygen species, ROS)抵御病原微生物入侵，并清除破损的细胞[8-10]。尽管早期炎症反应有利于伤口愈合，但多项研究显示损伤局部免疫细胞数量增加或炎性反应时间延长将引起损伤修复过程失调，最终导致长期不愈合伤口或病理性瘢痕形成[11-13]。这主要是由于损伤局部持续产生的ROS破坏了细胞结构和功能，使正常的皮肤修复过程失调。
皮肤损伤2～10天后新的组织开始形成，修复进入增殖期。这一阶段主要包括血管新生、肉芽组织形成和再上皮化。血管新生是创伤修复的关键。巨噬细胞和损伤的内皮细胞释放FGF-2、VEGF，促进血管新生[14-15]。随后，毛细血管出芽浸润损伤部位，与成纤维细胞、免疫细胞形成肉芽组织，为细胞新陈代谢提供营养及氧气。最后，EGF、TGF-β等生长因子刺激损伤边缘角质形成细胞增殖、迁移，使损伤真皮实现再上皮化[16]。再上皮化过程完成后，角质形成细胞发生分化，重新恢复表皮屏障功能。与此同时，真皮层成纤维细胞增殖并迁移至损伤部位，产生大量细胞外基质[17]。在这一阶段末期，生长因子(TGF-β)或机械压力刺激部分成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞表达肌动蛋白(α-smooth)促进伤口收缩。
组织重构一般发生在损伤后2～3周，可持续多年。在这一阶段，损伤激活的信号逐渐减弱。一旦伤口再上皮化完成，角质形成细胞停止增殖和迁移，随即开始分化。新生组织内的血管逐渐成熟，形成一个功能网[18]。大部分内皮细胞、炎性细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞发生凋亡或从伤口处撤回[19]。早期修复过程中形成的肉芽组织逐渐被新生的富含胶原的真皮基质取代。值得注意的是，正常皮肤组织主要由III型胶原形成筐篮编织结构组成，而损伤部位重构为较粗的I型胶原，并形成致密的平行结构[20-21]。表皮附属器，如毛囊、皮脂腺等在这一过程中一般不能再生。因此，新形成的组织通常与健康组织不同，表现为疤痕，以弹性、抗张强度下降为主要特征。
皮肤损伤修复涉及不同细胞之间复杂而有序的相互作用，包括上皮细胞、免疫细胞(中性粒细胞、巨噬细胞等)、内皮细胞及成纤维细胞等，通过改变基因表达和细胞表型协同调节伤口损伤修复过程[22-23]。
上皮细胞(即角质形成细胞)是伤口愈合再上皮化过程的主要执行者，通过迁移、增殖和分化恢复表皮屏障功能。皮肤损伤刺激上皮细胞改变表型，降解与邻近细胞或基底层细胞间的连接(分别为桥粒、半桥粒)，从而使上皮细胞从损伤边缘迁移至损伤局部并增殖[24-26]。新近研究揭示了多种调控上皮细胞增殖、迁移的分子机制，如自噬信号通路[27]、MicroRNA分子[28-30]及表观遗传调控[31-32]等。上皮细胞与多种类型细胞间相互作用，协同促进伤口高效愈合。在炎症阶段，上皮细胞分泌促炎因子和趋化因子，招募并活化巨噬细胞、中性粒细胞等[33]。在增殖初期，上皮细胞分泌的IL-1和TNF-α刺激成纤维细胞分泌细胞因子，而后者进一步促进上皮细胞增殖与迁移[34]。在血管新生阶段，上皮细胞分泌VEGF作用于内皮细胞，促进血管新生。在损伤修复末期，成纤维细胞分泌的TGF-β诱导上皮细胞分化，抑制增殖[35]。总而言之，在损伤修复阶段，上皮细胞与其他细胞间的交叉对话对创面愈合有重要作用，其中的任何阶段不平衡都有可能影响创伤愈合。
研究显示，人体中多种免疫细胞与损伤修复过程密切相关，如中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞等。在此我们讨论最主要的免疫细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)的变化对皮肤损伤愈合过程的影响。
3.2.1 中性粒细胞
正常情况下皮肤中不含中性粒细胞。皮肤损伤几分钟内，血小板脱颗粒产物、细菌降解产物及细胞外基质分解产物等物质迅速招募中性粒细胞进入损伤部位[8-9]。在无持续感染的情况下，中性粒细胞通常在损伤部位停留2～5天后凋亡[36]。损伤部位的中性粒细胞通过吞噬和产生活性氧(ROS)及中性粒细胞胞外诱补网(neutrophil extracellular traps, NET)抑制病原微生物入侵，清除细胞碎片[37-38]。皮肤表面通常含有多种共生细菌或病原菌，因此皮肤损伤后不太可能处于无菌状态，总会招募中性粒细胞至伤口处。成熟的中性粒细胞含700多种蛋白，如生长因子、促血管生成因子储存在颗粒中[39]，在外界信号刺激下，中性粒细胞可以直接通过脱颗粒作用迅速释放多种蛋白，促进血管再生、组织修复等，而不依赖于转录过程。中性粒细胞也能通过调节其他细胞功能，间接影响损伤修复过程。例如，损伤局部巨噬细胞从早期炎症表型(即M1型)转变为后期修复表型(即M2型)依赖于其对凋亡中性粒细胞的吞噬效应[40]。凋亡的中性粒细胞释放“eatme”信号，诱导巨噬细胞上调吞噬相关基因表达，并诱导释放修复相关细胞因子，如TGF-β和IL-10[40]，提示靶向中性粒细胞凋亡的药物具有促进伤口愈合的潜力[41]。
临床前及临床研究均提示中性粒细胞对有效的损伤愈合有重要作用。机体中性粒细胞缺乏时将导致伤口愈合不良，严重者甚至危及生命[42]。CXCR2受体对中性粒细胞募集至关重要，当小鼠CXCR2基因缺陷时，皮肤再上皮化过程延长，最终导致伤口愈合延迟[43]。此外，机体衰老导致损伤修复受阻似乎也与中性粒细胞功能有关。有报道显示中性粒细胞缺失不影响年轻小鼠(约2月龄)伤口愈合，却能延迟月龄稍大的小鼠(6、10或20月龄)损伤修复[44]，提示衰老过程伴随着中性粒细胞功能改变。值得注意的是，尽管免疫细胞影响皮肤损伤修复的多个方面，但过多炎性细胞浸润或激活可能会导致慢性不愈合伤口或病理性瘢痕形成，从而破坏正常组织结构和功能[45-46]。这说明炎性细胞在损伤修复过程中具有两面性。
3.2.2 巨噬细胞
皮肤损伤2～3天后，巨噬细胞募集至伤口处。在健康小鼠中，皮肤损伤愈合通常需要2周，巨噬细胞浸润在第3天达到峰值，第5天开始逐渐减少，到第10天恢复基线水平[47]。除损伤局部定植的巨噬细胞，其余大部分由腹膜来源的单核细胞分化而来[48]。巨噬细胞参与皮肤损伤修复的多个环节，包括宿主防御、炎症发生与消退、吞噬及生长因子分泌等。目前，大家一致认为，巨噬细胞具有非常强的可塑性，通过改变表型及基因表达影响损伤修复。损伤修复早期，大部分单核细胞在组织中极化为促炎的M1型巨噬细胞，进而释放促炎分子，如IL-6、IL-1β、TNF-α、ROS及NO等，有利于快速清除病原体及凋亡或坏死的组织[49]。随着伤口愈合推进，巨噬细胞由M1型转变为抗炎表型，即M2型[50]。M2型巨噬细胞释放TGF-β、IL-10、VEGF-A等，促进损伤修复[51-53]。巨噬细胞表型的改变主要与微环境有关。但在损伤微环境中巨噬细胞是通过何种具体机制调节表型改变及特定组织相关的巨噬细胞分型仍然有待将来进一步探索。值得读者注意的是，近年来研究显示仅仅将巨噬细胞分为M1和M2型过于简单，两者描述的仅仅是比较极端的情况，M1与M2间还存在多种激活表型[54]，但为了研究方便，大部分研究者目前仍然沿用这一表述方式。
鉴于巨噬细胞在伤口愈合不同阶段分泌的因子不同，我们不难理解巨噬细胞在不同阶段对损伤修复的贡献有所差异。利用条件敲除小鼠调控皮肤损伤后不同阶段巨噬细胞耗竭，结果显示：早期耗竭显著减少肉芽组织和疤痕的形成；中期耗竭导致损伤组织严重出血；晚期耗竭则对损伤修复无显著影响[55]。同样，在肝损伤修复小鼠模型中也显示不同时期巨噬细胞损耗对组织修复影响不同[56]。这些研究进一步强调，巨噬细胞在损伤修复过程中有复杂的作用及动态变化。因此，调节损伤修复过程中特定修复阶段的巨噬细胞功能和活性或许是促进皮肤良好修复的有效手段。
内皮细胞位于血管内表面，是参与新生血管形成的主要细胞成分。皮肤损伤后，血供减少及细胞代谢加速导致损伤部位缺氧。组织缺氧诱导多种细胞高表达HIF1，刺激分泌促血管生成因子VEGF、FGF、PDGF-B、TGF-β等，最终激活内皮细胞增殖、迁移，促进新生血管形成[57]。内皮细胞通过出芽的方式启动血管生成。机体中主要有3种内皮细胞亚群调控出芽：①接受VEGF信号，引导出芽的顶端细胞；②增殖活性强，延长出芽的茎细胞；③维持血管完整性的方阵细胞。出芽的内皮细胞最终形成管腔，建立细胞与细胞间连接，形成成熟血管网。
内皮细胞表面受体表达对血管新生起着重要的作用。生理条件下，内皮细胞表面受体表达较低，抑制免疫细胞、血小板与之结合。在皮肤损伤和趋化因子刺激下，内皮细胞表达P-selectin和E-selectin受体，促进免疫细胞黏附并浸润至损伤部位。同时，内皮细胞上调ICAM-1或VCAM-1表达，减慢免疫细胞迁移速度。实验显示，以上基因缺陷将抑制小鼠血管生成及损伤修复过程[58-60]。这一研究强调了损伤修复过程中内皮细胞与免疫细胞相互作用的重要性。
成纤维细胞广泛分布于真皮组织中，分泌富含胶原的细胞外基质。皮肤损伤修复过程中，血小板或巨噬细胞释放PDGF、IL-1β、TNF-α等趋化因子，招募成纤维细胞进入损伤部位。成纤维细胞分泌MMPs降解纤维蛋白凝块，产生胶原蛋白，为新生血管生成、肉芽组织形成和再上皮化提供支持和信号分子。约一周后，部分成纤维细胞在TGF-β刺激下结构和功能发生改变，分化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞合成ECM蛋白、黏多糖(glycosaminoglycans)等，同时表达α-SMA，产生收缩压力将伤口边缘连接到一起，从而促进伤口愈合。当损伤修复完成后，肌成纤维细胞凋亡并从伤口清除，这一过程受阻或过度激活将导致纤维化和疤痕形成。因此，探索肌成纤维细胞的功能及其如何被微环境调控或许能为疤痕治疗提供更多的选择。
近年来，成纤维细胞的异质性引起研究者极大兴趣。研究表明，皮肤中的成纤维细胞呈现明显的异质性，不同亚群的成纤维细胞呈现不同的表型，在损伤修复中有不同的功能，如合成细胞外基质、合成细胞因子和生长因子及免疫调节功能[61-62]。最近，Driskell等[63]研究报道，乳突状真皮层的成纤维细胞主要参与损伤修复的再上皮化及毛囊形成，而真皮下方的网状层成纤维细胞主要参与细胞外基质合成，促进早期疤痕形成。在未来，研究导致纤维化或疤痕形成的不同成纤维细胞亚群对疾病诊断和靶向治疗有重要意义。
众所周知，伤口修复的最终结果通常与伤口大小、组织器官类型、发育阶段及生物种类等密切相关。浅层皮肤损伤通常能恢复其屏障功能。但实际上，大部分损伤，如烧伤、刀伤、感染性伤口等通常深入真皮，这些伤口愈合后往往形成色素沉积的疤痕。疤痕不仅影响美观，而且可能造成皮肤等器官功能的丧失，影响患者生活质量。促进损伤修复并减少疤痕形成，最大限度恢复皮肤功能是医学领域研究的热点和难点。目前仍然缺乏有效的疤痕治疗策略。研究疤痕形成与完美修复的潜在关联将为探索新的治疗方式提供基础。
疤痕形成与炎症状态密切相关[64]，这一观点在皮肤纹身中被进一步证明。纹身师通过电针将染料刺进真皮，随后成纤维细胞吞噬染料长久保存于细胞中。有趣的是，尽管纹身引起较大、较深的皮肤损伤，但不会导致疤痕形成，而同样大小的切口或组织切除却总会形成疤痕。Ferguson及其同事[65]研究揭示，纹身电针较细小，通常不会引起炎症应答。另一方面，纹身局部伤口TGF-β1表达水平较低，而TGF-β1是导致疤痕形成的重要因素[65-66]，因此纹身导致的皮肤损伤能实现无疤痕愈合。
胚胎时期，人体皮肤损伤后能实现完美修复[67]，而成年时期的修复却总是伴随着疤痕的产生。当皮肤深层组织损伤时，会导致更严重的结果——病理性疤痕。临床上病理性疤痕分为增生性瘢痕和瘢痕疙瘩两种。胚胎与成年时期皮肤损伤修复的差异可归纳为[68-69]：①ECM组成不同。胚胎和成年皮肤胶原纤维的大小及方向不同。胚胎无疤痕伤口主要含富含弹性的胶原III，而成人皮肤伤口主要为较坚硬的胶原I，因此伤口修复后留下疤痕；②胚胎时期伤口呈现极轻微炎症反应。免疫反应的程度、持续时间及参与反应的免疫细胞类型均影响损伤修复的结果，而胚胎时期免疫系统不成熟，免疫细胞总数较少，且分化程度低；③TGF-β类型不同。与成人伤口完全相反，胎儿伤口TGF-β1表达较低，而TGF-β3相对较高。胚胎时期，TGF-β3信号能抑制免疫细胞活性及胶原合成。理解这些不同，将有利于疤痕修复治疗方法的开发。
人体大部分组织与器官再生能力有限。由于意外、手术或疾病导致的四肢或器官缺失不会再生出来。尽管一些伤口能愈合，却伴随着疤痕的产生。有趣的是，并不是所有的动物都如此，科学家发现一些低等生物拥有较强的组织再生能力。涡旋虫是扁形虫的一种，包括淡水扁虫和日本三角涡旋虫，具有很好的组织再生能力，是再生医学研究领域的重要工具。将涡旋虫切成若干块，每一小块最终都会发育为带有头部和尾巴的新蠕虫，基因表达与原蠕虫也完全一致。
不过令人诧异的是，随后研究发现并不是所有的涡旋虫亚类都具有如此强的再生能力。如乳白线虫类涡旋虫的再生能力则有限，含有头部组织能实现完全再生，而仅含有尾部不能再生出头。随后，科学家发现这一现象与Wnt信号通路有关，抑制Wnt信号能促进其组织再生。人为抑制尾部Wnt信号后，乳白线虫尾巴能再生出头[70]。此外，研究者发现涡旋虫的组织再生能力与干细胞(即成体未分化的细胞，neoblasts)密切相关[71-73]。一旦涡旋虫发生损伤，干细胞迁移至伤口处，并在此分化为需要的细胞类型，实现组织再生。这一研究提示，干细胞治疗是实现组织完美修复极具潜力的治疗方式之一。
一些较低等生物如扁形动物和蝾螈不仅能够修复伤口，还具备完全的再生修复能力。然而，哺乳动物的组织再生能力非常有限，损伤后组织器官不能完全恢复原有的形态和功能。如何实现组织完美再生或修复仍然是一个尚未解决的医学问题。为什么有些生物和组织在整个进化过程中一直保持着完全再生的能力，而其他生物和组织却失去了这种能力？现在看来，快速修复可能是在漫长进化过程中生物为了降低感染的一种适应。研究不同种类模式动物的损伤修复机制，将有助于我们理解人体损伤修复机制，为更有效实现完美修复提供支持。参考文献：略
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