CRISPR基因编辑应遵循的规则

DNA双链

当使用CRISPR技术进行基因编辑时，DNA断裂通常会相当可靠地发生，但DNA修复却往往并非如此。近日，美国约翰·霍普金斯大学Geraldine Seydoux博士课题组通过实验验证了基因编辑过程中DNA高效修复的两个必要条件；线性供体DNA与约35个核苷酸的短片段长度。

该研究对应论文则发表于最新上线的PNAS，名为Precision Genome Editing Using Synthesis-Dependent Repair of Cas9-Induced DNA Breaks。

Geraldine Seydoux博士及其同事将多种供体DNA的组合插入人类胚胎肾细胞中并使用供体荧光蛋白编码DNA对基因的插入进行了验证。

研究人员发现，在基因编辑的过程中，线性目的DNA片段的编辑效率相对更好，质粒的编辑效率高出2-5倍。同时，文章的作者指出：“通常情况下，生物实验室可以通过PCR轻易地制备线性DNA。”

与此同时，研究人员还对不同长度同源片段的编辑效率进行了测定，他发现最佳长度的同源臂比那些科学家通常使用的要短得多。具体而言，长度为33至38bp的同源臂在最佳条件下能够产生10％至20％的成功编辑。相反，当科学家对长度为15和16bp的同源臂时进行测试时，插入的成功率则会下降一半。他们在人类基因组的三个不同位置重复了这些结果。

总体来看，该基因编辑实验的总体成功率为10％至50％，插入长度为57至993bp片段。在这些基因编辑试验中，较短的序列比较长的序列更易插入，例如，57，714和993bp片段同样时间内插入的成功率分别为45.4％，23.5％和17.9％。而当片段长度超过1000bp时，有效编辑则变得很难发生。

最后，研究小组还发现，当新序列位于离CRISPR切割位点两端30个核苷酸内时，编辑成功率就会出现峰值。而当新序列位于切割位点30个核苷酸之外时，成功的编辑则变得难以发生。

除了常用的人类胚胎肾细胞之外，研究人员还在小鼠胚胎中验证了这些发现。

参考资料：Precision genome editing using synthesis-dependent repair of Cas9-induced DNA breaks.doi:10.1073/pnas.1711979114.

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