近年来，基因治疗技术飞速发展，尤其是以CRISPR为代表的基因编辑技术的进步，让人类最终战胜遗传病带来无限希望。详情见：基因治疗时代已经到来
线粒体（mitochondrion），是细胞的“能量工厂”，线粒体内有一套独立于细胞核的遗传物质——线粒体DNA（mtDNA），人类mtDNA的长度为16,569bp，拥有37个基因。mtDNA突变会带来母系遗传Leigh综合征、线粒体肌病、Leer遗传性视神经病、共济失调舞蹈病、骨骼肌溶解症等几十种遗传疾病。
图1--细胞--线粒体--线粒体DNA
为解决线粒体遗传病，英国于2015年10月允许通过线粒体移植生育“三亲婴儿”，2016年4月，世界上第一个“三亲婴儿”诞生，值得一提的是，这一项目由华人科学家张进主导完成。
2018年9月24日，Nature Medicine杂志同期发表两篇论文，使用基因编辑技术，成功治愈线粒体遗传病。这两篇论文使用了 ZFN（第一代基因编辑）和TALEN（第二代基因编辑），并没有使用近年来火到不能更火的第三代基因编辑CRISPR技术。关于ZFN、TALEN、CRISPR的原理，见本文末附录。
这两篇论文分别是：
来自剑桥大学的：Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo（图2），使用腺相关病毒（AAV9.45）递送的全身施用的靶向线粒体的锌指核酸酶（mtZFN），在整个心脏中的特异性消除突变线粒体DNA，有效改善心脏代谢功能。
来自迈阿密大学米勒医学院的：MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation，（图3）使用腺相关病毒（AAV9）递送靶向线粒体的TALEN（mito-TALEN），在肌肉和心脏中有效降低了突变线粒体DNA，有效恢复相关疾病表型。
图2--线粒体中的基因组编辑校正了体内致病性mtDNA突变
图3--MitoTALEN降低突变体mtDNA载量并恢复异质mtDNA突变小鼠模型中的tRNAAla水平
ZFN编辑线粒体DNA
线粒体疾病是一组广泛的遗传性多系统疾病，其中很大一部分通过线粒体DNA（mtDNA）的突变传播，据统计5,000个成人中至少有1个患线粒体遗传病。人mtDNA是一种小的双链多拷贝基因组，每个细胞约100-10,000个拷贝。
在疾病状态下，突变mtDNA通常与野生型mtDNA共存，疾病严重程度就看突变mtDNA在全部mtDNA中的比例。
突变mtDNA超过60%时，往往就会表现出疾病症状，目前已有不少研究在推动将突变mtDNA比例降低到60%以下。其中一种方法就是使用靶向线粒体的锌指核酸酶（mtZFN）。
哺乳动物线粒体缺乏有效的DNA双链断裂修复机制，选择性地将双链断裂引入突变体mtDNA，从而引起它们的快速降解。mtDNA拷贝数在细胞中相对稳定，突变mtDNA选择性消除后，会刺激剩余野生型mtDNA的复制，从而降低突变mtDNA比例。
论文中通过腺相关病毒AAV9.45将靶向突变mtDNA的ZFN通过尾静脉注射入小鼠。
中等剂量（5 × 10E12vg/小鼠）的效果最好，突变体mtDNA比例由73%降低到37%，小鼠的心脏的分子和生物化学表型得到有效逆转。
高剂量（1 × 10E13vg/小鼠）效果其次，突变体mtDNA比例由73%降低到40%，这可能是因为高剂量的AAV带来脱靶效应，导致野生型mtDNA也被清除。
低剂量（1 × 10E12vg/小鼠）几乎没有效果，突变体mtDNA比例由73%降低到71%，这可能是因为低剂量的AAV没有导入足够的ZFN。
TALEN编辑线粒体DNA
基因编辑工具已经成功的在体外培养细胞中选择性降低突变mtDNA的水平，这些方法的关键是细胞有维持稳定mtDNA拷贝数的能力，这导致剩余的mtDNA复制后重新填充细胞器。
线粒体DNA（mtDNA）的突变导致多种代谢紊乱，通常涉及肌肉和中枢神经系统。由于mtDNA在氧化磷酸化中的关键作用，大多数致病性mtDNA突变是异质的，因此突变型mtDNA与野生型mtDNA共存。
使用具有异质mtDNA突变的小鼠模型，通过肌肉内、静脉内和腹膜内注射给予AAV9-mitoTALEN。肌肉和心脏被有效转导并显示出突变mtDNA的强烈减少，其随时间稳定。
这些结果表明，通过AAV递送的靶向突变线粒体DNA的mitoTALEN可以有效恢复小鼠的疾病相关表型。
有意思的是，这两篇论文均未提及CRISPR技术，主要是因为，1、线粒体基因组相对较小，人mtDNA16569bp，缺少足够的CRISPR可编辑位点；2、CRISPR必须依赖gRNA才能发挥作用，而目前并无有效方法将外源RNA导入线粒体内。因此CRISPR基因编辑面对线粒体基因就显得束手无策。
实际上，BioMed Research International杂志于2015年8月刊登了一篇来自韩国成均馆大学的题为：Efficient Mitochondrial Genome Editing by CRISPR/Cas9的研究论文，该论文宣称使用CRISPR/Cas9技术成功编辑了线粒体基因。但是该论文并未提供有效的证据表明 CRISPR/Cas9可以编辑线粒体基因，因此该结果未被认可，感兴趣的读者可以看看这篇论文。
附录
基因编辑技术可以分为三代，第一代：ZFN；第二代：TALEN；第三代：CRISPR。这三个基因编辑技术都利用了DNA修复机制，所以我们先来了解一下DNA修复机制（图4）。
图4-NHEJ修复（左），HDR修复（右）
NHEJ（Non-homologous end joining）非同源性末端接合
NHEJ修复机制不需要任何模版，修复蛋白直接将双股裂断的DNA末端彼此拉近，在DNA连接酶的帮助下重新接合（图4）。
HDR（Homology directed repair）同源重组修复
当细胞核内存在与损伤DNA同源的DNA片段时，HDR才能发生。
NHEJ的机制简单又不依靠模版，因而NHEJ的活性相对于HDR高出许多。但NHEJ修复出错的概率较高，容易造成移码突变等，基因编辑正是利用了这一点。
1.ZFN的识别切割机制
融合锌指模块和FokI切割结构域形成ZFN ；以二聚体的形式靶向切割每个锌指结构；特异识别3个碱基 ；组装多个锌指结构(识别12-18bp)形成的ZFN对可特异切割基因组靶点 （图5）。
图5-ZFN基因编辑原理图
2.TALEN的识别切割机制
两个TALE靶向识别靶点两侧的序列；每个TALE融合一个FokI内切酶结构域；FokI通过TALE靶向形成二聚体切割靶点；设计灵活识别特异性强（图6）。
图6-TALEN基因编辑原理图
3.CRISPR/Cas9的识别切割机制
crRNA通过碱基配对与 tracrRNA结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA（图7）。
图7-CRISPR/Cas9基因编辑原理图
参考文献：
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Bacman, S. R., Williams, S. L., Pinto, M., Peralta, S. & Moraes, C. T. Specific elimination of mutant mitochondrial genomes in patient-derived cells by mitoTALENs. Nat. Med. 19, 1111–1113 (2013).
Hashimoto, M. et al. MitoTALEN: a general approach to reduce mutant mtDNA Loads and restore oxidative phosphorylation function in mitochondrial diseases. Mol. Ther. 23, 1592–1599 (2015).
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