人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的诊断主要依赖于实验室检测，包括HIV抗体和/或p24抗原，以及核酸检测（NAT）即HIV RNA检测。一般而言，人体感染HIV后，1周左右即可检测到HIV RNA，约2周后p24抗原阳性，3周左右可检出针对HIV核衣壳和包膜蛋白的各种抗体，见图1[1, 2]。但上述检测方法的“窗口期”的估算，是针对HIV暴露前或暴露后没有进行预防性抗逆转录病毒治疗（ART）的患者，并且是建立在感染者能产生足量的HIV抗体的前提下；事实上，20多年前就有文献报道，有感染者HIV RNA阳性，却一直都检测不到HIV抗体[3]，之后陆续有类似的“血清学阴性”的HIV感染病例报道，最近我国学者还报道了一例罕见的、合并卡波西肉瘤的血清学阴性艾滋病病例[4, 5]，由此可见，血清学阴性的HIV感染并非新鲜事物，然而，全球有数以千万计的HIV感染者，迄今为止，血清学阴性HIV感染报道不超过30例，又足见其罕见程度。另外，“血清学阴性”HIV感染和俗称的“阴滋病”也不可混为一谈，“阴滋病”并非科学的医学术语，指“患者”主观感觉出现类似HIV感染的症状，但并没有实验室证据支持。作为医务工作者，我们应该对“血清学阴性”HIV感染的前因后果有一个客观、科学的认知，不能跟随媒体对这种罕见情形的过度渲染，而盲目夸大其严重性。
图1. HIV感染后血清学和分子生物学标志物的动态变化及相应检测技术的窗口期[1, 2]（点击图片可放大查看）
一、血清学阴性HIV感染的定义
虽然检测的样本类型都是血清或血浆，但“血清学检测”一般指抗体和/或抗原检测，而“分子生物学检测”则专指检测核酸。具体到HIV感染的实验室诊断，“血清学阴性”HIV感染，和“抗体阴性的HIV感染”属同一概念，指感染HIV后，患者血清HIV抗体用两种或以上品牌的筛查试剂检测，长时间（超过抗体检测窗口期）、持续（多次采血检测）保持阴性，但有其他HIV感染的证据，如HIV RNA、HIV DNA或病毒培养阳性等。
二、血清学阴性HIV感染者的实验室指标[5]
1．HIV抗体免疫印迹试验（也称“补充试验”或“确认试验”）：多数患者免疫印迹试验为阴性，抗体条带全部阴性；少数患者出现个别抗体条带，如p24和p17抗体条带，但不足以判定为阳性结果。
2．HIV RNA：多数患者有很高的病毒载量（>100000拷贝/ml）。
3．HIV病毒学特征：没有证据表明感染者携带的病毒是罕见的基因型或者突变株，提示不太可能是病毒突变引起的试剂漏检。
4．CD4细胞计数：仅有不到20%患者的外周血CD4细胞计数>200/μL，超过40%的患者CD4计数<50>
5．免疫球蛋白定量：血清免疫球蛋白浓度均处于正常水平，针对其他病原体或者免疫原的抗体水平也未发现异常，提示整体的体液免疫功能可能并没有受到损害。
三、血清学阴性HIV感染的临床表现
被HIV感染后，一些所谓的“精英控制者”（elite controllers）体内存在较强的针对HIV特异性的T细胞应答，并能产生广谱的中和抗体，从而可以有效控制病毒，控制疾病进展[6, 7]。而“血清学阴性”HIV感染者似乎是另一个“极端”人群——他们大约有一半在确诊时就已发生肺孢子菌肺炎，其他严重的机会性感染包括食管念珠菌病、结核、杆菌性血管瘤病和隐球菌病等。血清学阴性HIV感染者往往疾病进程更快，预后更差，大约60%的患者在确诊后8个月之内死亡[5]，当然，如此短的进程，也与未能及时做出诊断、未能及时抗病毒治疗有关。
四、血清学阴性HIV感染的成因
这些感染者为何不产生HIV抗体？目前仍没有能找到一个合理的解释。可以确定的是，血清学阴性HIV感染并非由于处于“窗口期”感染（急性感染）、抗体还没来得及产生所导致，也并非早期预防性ART或低丙种球蛋白血症引起HIV抗体缺失，此外，感染罕见HIV毒株引起筛查试剂漏诊的可能性也不大。
有意思的是，HIV传播者-感染者的配对研究结果显示，即使感染了同源的毒株，在配对的个体身上，疾病进展也迥异，一方表现为普通的疾病进程，但另一方则出现血清学阴性的HIV感染，病情迅速恶化。这就提示我们，疾病的进展与感染者本身有关。但与感染者的哪（些）方面因素有关呢？血清学阴性HIV感染者不会自然发生HIV抗体的血清学转换（抗体由“阴”转“阳”），但个别患者经过ART治疗后，病毒被抑制，T细胞得以重建，HIV抗体变为阳性，提示血清学阴性的HIV感染可能跟感染者体内T细胞数量和功能相关，但这种推测需要进一步研究证实。大部分感染者血清免疫球蛋白水平正常，也能检出针对其他病原体的特异性抗体，提示这些患者只是针对HIV特异性的细胞和体液免疫产生了缺失。还有研究提示，感染者HLA型别不同，对HIV的免疫识别也有差异[8]。
总之，血清学阴性HIV感染者缺失HIV特异性的细胞免疫和体液免疫，临床表现为病情较重且预后较差，但两者之间孰因孰果，目前并不能下定论。
五、血清学阴性HIV感染病例带给临床和检验医师的启示
1．血清学阴性的HIV感染的诊断：主要取决于临床医生
血清学阴性的HIV感染是极为罕见的疾病，病情往往比一般的艾滋病更加严重，及时、准确的诊断，对临床医生提出了很高的要求，需要具备良好的罕见病诊断和鉴别诊断的思维，需要能结合患者的临床表现，能及时想到检测HIV RNA。
2．检验医生面对HIV筛查试验“阴性”报告：可如实发送
血清学阴性的HIV感染，主要是由于感染者体内HIV抗体水平极低甚至缺失引起，与实验室检测则无太多的责任关联。只要实验室采用的是通过认证的、灵敏度符合要求的HIV血清学筛查试剂，就可以如实发送“HIV初筛试验结果阴性”的检验报告，这也符合我国艾滋病检验技术规范的要求。
3．第四代化学发光HIV筛查试剂可否有助于检出这类患者？——需要进一步研究
第四代试剂在第三代试剂检测HIV IgG和IgM的基础上，增加了p24抗原的检测（图2），p24抗原在感染早期即伴随HIV RNA出现，早于HIV抗体的产生。理论上，病毒复制过程中，需要p24组成核衣壳，将HIV RNA包裹其中，因此，病毒载量和p24水平应该成正相关。Respess RA等检测232份源于初治和经治艾滋病患者血清，发现两组患者血清p24抗原水平和RNA水平均成正相关；当HIV RNA水平高于30000拷贝/毫升时，p24 检出率为100% [9]。此外，既往报道的“血清学阴性”的HIV感染病例，大都使用酶联免疫吸附试验（ELISA）而不是灵敏度更高的化学发光（CLIA）技术进行筛查；CLIA技术检测抗体和/或抗原，有更高的灵敏度，目前被越来越多的检验实验室应用，可以推测，第四代CLIA试剂可能有助于检出血清学阴性的HIV感染者，然而目前为止，相关研究证据并不充分。
图2. 第四代HIV筛查试剂的原理[2]（点击图片可放大查看）
4．核酸检测（NAT）的重要性日益提高：核酸是病毒活动感染的直接标志物
近些年来，随着NAT技术的成熟和普及，各国都在不断强化NAT检测的地位，无论是对献血和血浆制品筛查，还是在临床诊断上，NAT发挥越来越重要的作用。美国CDC在2014年推行新的HIV实验室报告导则，不再推荐免疫印迹作为HIV感染的确认方法，而用HIV-1/HIV-2抗体（快速）鉴别试验和HIV RNA试验取而代之（https://stacks.cdc.gov/view/cdc/23447）。新导则要求使用第四代的HIV试剂做初筛，旨在更灵敏地检出HIV早期感染者；使用快速HIV-1/2抗体鉴别试验，旨在提高检测的时效性，缩短结果报告时间，且帮助区分1型和2型HIV感染；使用NAT检测，可直接确诊有无HIV-1复制，并减少传统的HIV免疫印迹法存在的大量“不确定”结果引起的诊断困局（图3）。引申开来，在2013年，美国CDC也对HCV感染的实验室报告导则进行了革新，新导则也不再推荐重组免疫印迹法（RIBA）作为HCV感染的确认方法，而由HCV RNA检测取而代之[10]。遗憾的是，目前我国HIV RNA检测并没有广泛应用于临床检验实验室，如果能和HBV DNA和HCV RNA一样普及应用于临床实践，相信HIV感染会得到更及时、准确的诊断。
图3. 美国CDC在2014年更新的HIV实验室报告导则
5．弱化抗体免疫印迹确认试验的地位：是出于对抗体检测局限性的考虑
病原体抗体检测的局限在于：①免疫系统功能损害的感染者，不能产生足量病原体特异性抗体，导致血清学阴性的HIV、HCV等感染；②抗体检测有更长的“窗口期”[11]，检测极早期感染的灵敏度欠缺。如果献血员处于窗口期感染，单凭抗体检测结果，存在输血传播疾病（TTIs）的残留风险，我国从2015年开始已经在各血液中心和中心血站逐步实现NAT的集中化检测，目的就是将这种残留风险进一步降低。③抗体检测容易产生非特异性结果。人体免疫系统产生的抗体，具有类似的结构，通过免疫学方法准确区分不同的抗体往往难度很大，抗体检测也比抗原和核酸检测更易产生“低值阳性”的结果，例如，雅培第四代Architect HIV筛查试剂检测的S/Co值（signal-to-cut–off ratio）≥1即可判定为“阳性”，然而，现实世界的研究结果显示，对一般人群，S/Co在1-15之间的结果，均系试剂非特异性造成的“假阳性”结果；但另一方面，对于HIV感染高危人群而言，S/Co值在1-15之间的患者,仍有相当一部分为急性或非急性期HIV感染[12]。因此，抗体检测容易导致诊断的困局，我们往往无法分辨究竟是检验试剂特异性欠佳造成的生物学“假阳性”结果，还是患者体内确实有微量的抗体；即使继续进行免疫印迹检测，结果往往也是“不确定”。对于HIV感染这样严重的传染性疾病，不论对于被测试者，还是临床医生，结果的“阴性”还是“阳性”关系重大。这时候，还得继续检测NAT和/或抗原来帮助确诊。
6．NAT也不能100%准确诊断HIV感染
然而，凡事无绝对——HIV RNA检测也不是100%可靠。HIV是一种高度变异的病毒，在德国红十字会三年间270万例自愿献血员中，经血清学方法和NAT检测后，发现4例献血员感染HIV，但NAT试剂检测结果为“阴性”。进一步分析，两例样本是因为使用的核酸试剂扩增的靶片段（5’LTR区）出现了碱基缺失或突变，从而影响了引物和探针与病毒基因的结合，造成某些品牌的HIV RNA检测试剂的结果偏低甚至漏检[13]，见图4。因此，德国Paul-Ehrlich研究所（PEI）要求从2015年开始，所有上市的HIV RNA试剂，应至少保证HIV两个区段的扩增，以规避单一区段发生突变造成漏检的风险。剩余两例则是由于所用的核酸检测试剂灵敏度不足从而造成漏检，这和NAT检测试剂的灵敏度有关。
图4. HIV的5’LTR区片段缺失导致RNA试剂探针不能与之结合，造成结果“假阴性”（点击图片可放大查看）
对于HIV的检测，除检验技术问题之外，还涉及感染者是否进行抗病毒治疗的问题。前面提到的各个检测标志物的“窗口期”，是基于对HIV感染自然进程的推算；现实世界中，寻求HIV检测的人往往已在发生高危行为之前或之后预防性地服用抗逆转录病毒药物，因此，即使发生感染，HIV复制和相应抗体和/或抗原的产生也会变弱，导致窗口期推后，如果不仔细询问病史，生搬硬套理论，可能会导致部分感染者被漏检。此外，对HIV-2的感染，目前没有通过美国FDA认证的核酸试剂可供使用。
7．血清学阴性的病毒感染的概念具有普适性：不仅仅局限于HIV感染
抗体作为一种病原体感染的间接指标，受宿主免疫功能的影响，功能受损的免疫系统会导致抗体产生延迟、减少甚至缺失，因此，拓展开讲，血清学阴性的病原体感染不仅限于HIV感染，HCV、HBV等都存在类似现象。“血清学阴性”的HCV感染（HCV抗体持续阴性，HCV RNA阳性）也常发生在免疫缺损的人群中，例如，HIV/HCV合并感染者中，血清学阴性的HCV感染发生率为3.2%-13.2%[14]，我们在临床实践中注意到，个别干细胞移植的白血病患者也会出现血清学阴性HCV感染，且预后不良（尚未发表数据）。HBV感染者也有抗-HBc的缺失，例如，Anastasiou OE等检测了1568例HBV DNA阳性患者中的抗-HBc，发现19例患者抗-HBc为阴性，这19例患者大都存在免疫抑制，例如合并恶性疾患、合并HIV感染或经历了实体器官移植[15]。此外，在隐匿性HBV感染（OBI）者中，部分感染者抗-HBc为阴性，但在血清和肝脏中能检测到HBV DNA[16]。面对这些特殊的患者，临床医生就不能过分依赖抗体初筛结果，而应及时检测核酸和/或抗原，以确认是否存在病毒活动性感染，及时进行抗病毒治疗，以免延误抗病毒治疗，影响患者预后。
另一个例子是，有人接种HBV疫苗，然而始终无法产生抗-HBs，这也印证了不同个体免疫系统对病毒抗原的反应不同，产生抗体的能力也有很大差异。
六、总结
首先，极少数HIV感染者由于种种原因，不产生抗体，但这种情形非常罕见，有待于进一步研究；HIV抗体的检测仍然是比较可靠的、一线的HIV感染筛查手段。但抗体是感染的间接指标，检测的“窗口期”长，因此诊断急性感染不如抗原和NAT灵敏，推荐使用第四代HIV抗原/抗体CLIA试剂和NAT检测，以更灵敏检出急性HIV感染者。急性感染者往往携带高载量病毒，极易造成HIV传播，而尽早开始ART治疗也符合患者利益。第二，抗体阴性的感染不仅局限在于HIV感染，也存在于HBV、HCV等病毒感染。第三，HIV基因的高度可变可能导致NAT试剂漏检，此外，服用抗逆转录病毒药物也可能抑制抗体和RNA的产生，因此，HIV感染的诊断，涉及医学和社会学问题，血清学和NAT都不可能100%地准确诊断HIV感染，所以应紧密结合临床表现，综合应用各种检验指标，这也是新时代传染性疾病诊断对我们提出的要求。
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