PD-L1表达与检测
PD-L1表达与检测
PD-1属于T细胞共抑制受体，在活化的T、B细胞、NK细胞、单核细胞和树突状细胞上均表达 PD-1 受体，与其配体、处于APC细胞表面的PD-L1（即B7-H1）、PD-L2（即B7-DC）相互作用，抑制T细胞的活化，维持T细胞免疫稳态；而在许多肿瘤环境中，肿瘤细胞高表达PD-L1分子，与肿瘤部位浸润T淋巴细胞表面的PD-1分子结合后，抑制T细胞活性，实现肿瘤的免疫逃避。
而目前PD-1/PD-L1抑制剂均是检测PD-L1的表达。PD-L1的检测是基于细胞蛋白水平的检测，因此临床试验中以免疫组化方法为主。
免疫组化是检测蛋白表达的经典手法，其通过抗体着色后由病理医师镜下观察根据着色深浅来评价表达情况。目前在NSCLC治疗中，对于每个PD-1/PD-L1抑制剂，开发了特异性PD-L1免疫组化（IHC）检测方法，以评估NSCLC中恶性肿瘤和/或免疫细胞上的PD-L1表达水平。
PD-L1检测的临床意义
早期研究显示，PD-L1的表达与PD-1/PD-L1抑制剂的疗效相关。KEYNOTE-001的Ⅰ期研究结果发现，PD-L1高表达的NSCLC患者从pembrolizumab中获益最大，特别是PD-L1表达>50%的患者，客观缓解率（ORR）、中位无进展生存（PFS）、总生存（OS）显著好于＜50%的群体。
晚期NSCLC患者PD-L1的表达水平与患者使用nivolumab的疗效亦存在关联，CheckMate 057研究的非鳞NSCLC患者中，nivolumab治疗组优于多西他赛治疗组的OS获益几乎全部都由肿瘤细胞PD-L1＞10%患者所贡献。Nivolumab联合ipilimumab用于晚期NSCLC的研究中也证实，PD-1≥1%的患者有效率更高，PD-L1≥50%的患者的有效率高达90%以上。
KEYNOTE-010、KEYNOTE-024研究结果也表明，PD-L1表达对pembrolizumab至关重要。基于KEYNOTE-024研究结果，FDA批准对于PD-L1表达≥50%，且无明确驱动基因突变的初诊的晚期NSCLC患者可以一线选择pembrolizumab。目前，PD-L1检测已经写进了肺癌NCCN指南。此外，相关临床试验的研究显示在其它肿瘤中，PD-L1的表达水平与患者使用免疫检查点抑制剂的疗效亦存在关联。
PD-L1检测的现状与问题
PD-L1表达检测目前主要是两家公司的4种检测技术，如下表。
PD-L1 IHC 28-8 pharmDx，应用兔单抗28-8和EnVision FLEX可视系统，在Autostainer Link 48染色平台上检测非小细胞肺癌（鳞癌除外）和黑色素瘤石蜡切片中PD-L1的表达状况，从而指导临床用药。PD-L1蛋白表达的定义是肿瘤细胞所呈现的任何强度的细胞膜阳性的百分率，细胞质染色（如果存在）不参与评分。
PD-L1 IHC 22C3 pharmDx，应用小鼠单抗22C3和EnVision FLEX可视系统，在Autostainer Link 48染色平台上检测非小细胞肺癌石蜡切片中PD-L1的表达状况，从而指导临床用药。
PD-L1蛋白应用TPS（Tumor Proportion Score）来定义，即呈现部分或完整细胞膜染色的可视肿瘤细胞的百分率。 VENTANA PD-L1 (SP142) Assay，应用兔单抗SP142和OptiView DAB IHC检测试剂盒，在VENTANA BenchMark ULTRA染色平台对尿路上皮癌的石蜡切片进行PD-L1表达的分析。PD-L1表达状况定义为任何强度PD-L1的浸润免疫细胞（IC）所占据的肿瘤细胞面积的百分比，肿瘤细胞上的PD-L1表达不参与评分。在尿路上皮癌中≥5% IC与使用药物所带来的客观缓解率增加密切相关。
但是在NSCLC，除了继续沿用针对IC表达进行评判之外，也加入了对于TC的评判，是唯一一个对肿瘤细胞和浸润的淋巴细胞均加以考虑的检测试剂，评估基于PD-L1任何强度表达的肿瘤浸润性免疫细胞占肿瘤面积的比例（% IC）或PD-L1任何强度表达在肿瘤细胞中的比例（% TC）。
VENTANA PD-L1（SP142）检测测定的NSCLC组织中≥50% TC或≥10% IC有PD-L1表达可能与atezolizumab提高总生存率相关。 VENTANA PD-L1 (SP263) Assay，应用兔单抗SP263和OptiView DAB IHC检测试剂盒，运用VENTANA BenchMark ULTRA染色平台检测PD-L1在尿路上皮癌的肿瘤或免疫细胞膜中的表达。
2017年5月5日，VENTANA PD-L1（SP263）检测获得CE认证，作为抗PD-1治疗KEYTRUDA的体外诊断检测，检测NSCLC肿瘤细胞（TC）膜中PD-L1的表达水平有助于识别适用pembrolizumab治疗的患者。通过VENTANA PD-L1（SP263）检测出NSCLC肿瘤细胞（TC）膜中PD-L1的表达水平可能与nivolumab治疗后生存期延长有关。
目前PD-L1检测仍然存在一些问题包括：检测技术方面，如不同的检测抗体、平台以及不同的阈值的问题；生物学方面，如肿瘤内和肿瘤间异质性；组织来源方面，如细胞学标本，存档标本与新鲜标本，原发部位与转移灶等。
检测技术方面
目前PD-1/PD-L1抑制剂都有对应的PD-L1检测方法，但是每种检测所用到的抗体和技术都不同，导致PD-L1表达水平的设定不同，同时对于不同的瘤种PD-L1表达水平的设定也不同。
国际肺癌研究协会（IASLC）在内的多个国际组织都在努力推进不同PD-L1表达检测技术分析，以期能够提供不同检测间可靠的对比数据。在Blueprint 研究中，39份NSCLC的蜡块样本的系列切片采用各自药物临床试验所用的检测方法来分析PD-L1表达水平，由3个病理专家来阅读和解释对肿瘤细胞和免疫细胞的检测结果。
结果显示三种抗体（28-8, 22C3, SP263）的IHC分析在肿瘤细胞具有很好的一致性，而SP142抗体染色肿瘤细胞相对较少。四种抗体对免疫细胞都有不同程度的染色，但一致性较差。
Blueprint 2 研究旨在用现实世界实践中的临床肺癌样本，分析五种抗体（28-8, 22C3、SP142、SP263和73-10）的染色可比性。结果显示：28-8、22C3和SP263检测肿瘤细胞具有染色一致性，SP142 检出阳性细胞较少，而73-10检出更多的阳性细胞。镜下阅片和远程数字化图像阅片结果具有较好的一致性。
肿瘤组织中肿瘤细胞的染色评分的Kappa系数多数在0.8以上，具有高可靠性。而对免疫细胞的染色具有挑战性，一致性差而不可靠。对于细胞学样本，PD-L1染色的可靠性需要进一步确认。
生物学方面
Rehman等使用SP142评估了从35例切除的NSCLC肿瘤样本中获得的三个单独的组织块上的PD-L1表达，通过肿瘤细胞染色分析，每个肿瘤的所有三个组织块的PD-L1水平相似。
然而，当评估免疫细胞时，组织块之间的相关性仅为75％。Ilie等利用SP142评估了160例NSCLC患者的手术切除标本和肺组织活检标本的PD-L1染色。PD-L1染色存在明显差异，活检标本与手术标本（TC1/2/3和/或IC1/2/3，26％ vs 74％）。
在ATLANTIC试验（全球研究评估MEDI4736在局部晚期或转移性非小细胞肺癌患者疗效的临床试验）中，试验评估了肿瘤间异质性，并报道了原发性和转移性样本之间的PD-L1肿瘤细胞染色（35％ vs 33％），一致性为89％。
组织来源方面
Skov等使用28-8和22C3检测方法，比较了86例配对的肺癌细胞学石蜡标本和组织学标本PD-L1表达水平，观察两者之间的一致性。提示当组织学标本不可用时，通过处理细胞学材料对肿瘤细胞的PD-L1表达进行检测，是一种可接受的替代方法。
有证据表明，PD-L1表达具有动态变化的特点，随时间和治疗应答而波动、上调或下调，并且关于存档标本与新鲜标本的价值也是争论的焦点。但是在NSCLC中的相关研究经验表明，无论是新鲜标本还是石蜡标本，PD-L1检测都具有临床价值。KEYNOTE-001用的是新鲜手术标本，CheckMate 057用的几乎都是库存的标本，但两个研究中PD-L1对疗效的预测作用相似。
KEYNOTE-010研究中标本接近一半新鲜标本一半存档标本，两者PD-L1预测作用近似。2016年ESMO报告了迄今最大样本量的NSCLC PD-L1检测数据，包括4784例NSCLC，研究得出4项结论：鳞癌和腺癌的表达分布相似；经治和初治人群的表达分布相似；原发部位和转移灶的表达分布相似；新鲜标本和存档标本的表达分布相似。
小结
免疫治疗的2.0时代，如何使免疫治疗药物在肿瘤治疗中更加精准仍然是研究的主旋律，PD-L1检测方法的优化仅仅是一个部分。
PD-L1作为标志物分析有效性最终是需要获得临床药物疗效的验证。同时，我们还应充分认识到，药物敏感性预测标志物需要在PD-L1之外进一步探索，肿瘤浸润性免疫细胞、肿瘤突变负荷（TMB）、dMMR/MSI-H、基因特征等都是筛选患者的指标。
目前PD-L1检测、TMB检测以及dMMR/ MSI-H检测均已经应用于临床指导免疫检查点抑制剂的使用，但是三者之间有何联系目前尚不明确。在临床实践中如果想知道哪些患者对PD-1/PD-L1抑制剂治疗最有效仍是一个慢慢探索之路。
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组稿 I 王俊（湖北省肿瘤医院）
编辑 I 章必成（解放军武汉总医院）
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