微阵列比较基因组杂交检测在新生儿染色体异常疾病筛查中的应用

【摘要】

目的

探讨微阵列比较基因组杂交(Array－CGH)在新生儿染色体异常疾病诊断中的意义。

方法

选择我院新生儿病房2014年1～12月临床诊断不明、怀疑染色体疾病的患儿，采用Array－CGH技术对患儿进行全基因组扫描分析，并用荧光原位杂交(FISH)检查对检出的基因组不平衡异位进行验证。

结果

共纳入514例新生儿，发现染色体异常改变104例，异常检出率20.2%。其中最常见为唐氏综合征24例，其次为小胖威利/天使人综合征17例，Wolf－Hirschhorn综合征5例，威廉斯综合征5例，猫叫综合征5例。FISH检测结果与Array－CGH相符。

结论

通过Array－CGH技术对不明疾病原因的患儿进行全基因组扫描，部分患儿可明确病因诊断。该技术作为一种高通量、快速的疾病研究手段，在染色体疾病筛查诊断中具有重要的临床意义。

染色体数目或结构异常引起的疾病为染色体疾病，新生儿染色体疾病的早期诊断对达到最佳的处理与治疗非常重要^[1]。染色体显带已被运用几十年，因具有高度可靠性而成为染色体分析的金标准，但其分辨率较低(5～10 Mb)，而比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)虽然一次实验能对整个基因组进行筛查，可检测染色体的非整倍体、缺失、复制和扩增等，但分辨率仍较低(5～10 Mb)。微阵列比较基因组杂交(Array－CGH)具有高分辨率、高敏感性、高通量、自动化和快速等优点。国际标准细胞遗传学微阵列(ISCA)协会已达成共识，染色体Array－CGH检测可作为发育延迟和(或)先天异常个体评价的一线诊断试验^[2]。本研究对我院新生儿病房临床诊断不明、怀疑染色体异常的患儿进行Array－CGH检测，探讨其在临床诊断中的意义。

对象和方法

一、研究对象

选择2014年1～12月我院新生儿病房收治的临床表现有特殊面容、多发畸形、发育迟缓、纳奶困难及治疗困难，且不能明确诊断的患儿为研究对象。本研究经北京儿童医院临床中心伦理委员会批准，患儿家属均知情同意。

二、研究方法

1．标本采集及留取：

取患儿外周血(足跟或手指尖第2滴血)。应用G－Scanning采血纸(英国沃特曼公司)，采集2个直径>8 mm血斑，使血自然渗透。按标准流程提取DNA，通过随机引物法，使用Cy－3与Cy－5 dCTP对DNA进行标记共3 h。对标记的DNA进行纯化、溶解于杂交缓冲液过夜，冲洗玻片数次并保持干燥。

2．DNA检测：

将患儿DNA、对照DNA(指购买的带认证的正常细胞组)与附着在微阵列载玻片上的DNA克隆体进行杂交(基因芯片为韩国Macrogen公司生产的MAC Array Karyo 1440 BAC－chip)。基因芯片的特异度和敏感度平均0.1～2.3 Mb。结果判定：(1)患儿DNA量正常：绿色和红色相混合，出现黄色亮点；(2)患儿DNA量减少(微缺失等)：红色亮点增多；(3)患儿DNA量增多(微重复等)：绿色亮点增多。应用激光扫描器(LuxScan 10K微阵列扫描仪，北京博奥生物有限公司)获取玻片图像，并采用Mac Viewer软件进行分析。

3．染色体分析：

取患儿外周血提取的DNA，按照标准方法实施染色体分析。采用特异性探针对分裂间期或分裂中期染色体损伤进行荧光原位杂交(FISH)检查。按照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN，2013)对细胞遗传学分析进行描述^[3]。

4．临床特征分析：

因部分新生儿同时具备以下多项临床特征，故以主要特征记录病例，无重复记录。多发畸形(具备3个及以上)包括眼距宽、塌鼻、耳位低、唇腭裂、小下颌、多指(趾)、肛门闭锁、先天性心脏病、囟门闭合等；反应低下指哭声低哑、嗜睡、对弹足底刺激反应迟钝；肌张力减低包括主动肌张力及被动肌张力减低；纳奶困难指不进乳或明显低于日龄应纳乳量；难治性惊厥指常规抗惊厥药物治疗无效；严重脓毒血症指脓毒血症并发器官衰竭。

结  果

一、一般情况

共纳入514例新生儿，其中男365例，女149例；多发畸形164例，反应低下126例，肌张力减低98例，纳奶困难43例，难治性惊厥51例，严重脓毒血症32例。

二、Array－CGH检测结果

514例新生儿均行Array－CGH检测，检出染色体异常104例，检出率为20.2%，其中27例存在显著的染色体非整倍性，包括20三体(1例)、唐氏综合征(24例)、47，XYY(1例)或45，X(1例)；59例存在部分染色体缺失或微缺失，包括小胖威利/天使人综合征(Prader－willi/Angelman syndrome)17例；Wolf－Hirschhorn综合征5例、威廉斯综合征(Williams syndrome)5例，猫叫综合征(Cri－du－chat syndrome)5例等；另有18例染色体重复或微重复畸形。

三、FISH验证结果

Array－CGH结果异常患儿通过FISH结果证实，验证符合率100%。例如小胖威利/天使人综合征使用DNA芯片，将受检者的46条染色体中1 440个遗传部位进行扫描分析，检测到15q11.2q12区域缺失(见图1、图2)。

讨  论

Array－CGH是一种检测不平衡性染色体改变的有力工具，能准确检测微缺失、微复制和扩增等基因组不平衡，精准确定断裂点，并将结果直接定位于基因组上，为肿瘤、遗传性疾病及正常人群基因组DNA拷贝数变化的检测和研究提供了一种有效方法^[4,5,6]。

Array－CGH应用微阵列取代传统CGH的中期分裂相，使荧光标记的测试DNA探针和参照DNA探针竞争性地与微阵列上的短片段靶序列杂交。Array－CGH与传统染色体G显带核型分析相比，对一定水平的嵌合体诊断，更有优势。传统染色体G显带核型分析需要技术人员目测数目较多细胞才可正确诊断出嵌合体，相对Array－CGH对人力及技术经验要求更高。另外，染色体G显带核型分析需进行细胞培养，培养过程中异常核型的细胞处于竞争劣势，不易培养，可导致细胞培养后的嵌合体细胞水平较低甚至无法检测，且培养过程中可能发生基因突变，导致检测结果不准确。但也有研究使用传统染色体G显带核型分析与Array－CGH对染色体畸变进行检测，得出Array－CGH不能识别嵌合体的结论。究其原因，可能是由于染色体G显带核型分析结果存在假阳性，或嵌合体水平较低，未被识别所致。Fiorentino等^[7]2011年对Array－CGH在产前诊断中的应用进行前瞻性研究结果显示，Array－CGH可检测出低至10%水平的嵌合体。与传统CGH相比，Array－CGH技术灵敏度和精确度高，能够自动化和程序化。近年来，许多研究利用Array－CGH技术对遗传性疾病所伴随的染色体异常进行了全面系统分析^[8,9]，获得G显带和FISH相一致的结果，且前者具有更高分辨率，可大规模、高通量一次性检测所有染色体位点的异常，并能够自动分析结果，更加省时客观。在对某些标本的研究中，用Array－CGH还发现一些FISH技术未能检测到的染色体异常，提示Array－CGH在人类遗传性疾病的研究中具有广阔的应用前景。

本研究结果显示，筛选病例中阳性检出率为20.2%，常见染色体异常疾病为唐氏综合征，其次是小胖威利/天使人综合征、Wolf－Hirschhorn综合征、威廉斯综合征、猫叫综合征。在其余异常病例中发现的染色体缺失与重复伴有许多临床症状，如发育延迟及精神发育迟缓。本研究从进行染色体筛查病例的临床特征看，以多发畸形及反应差为主要表现，说明这些特征患儿检测出染色体疾病的可能性大。对于临床症状不典型，以及临床治疗困难的病例，应加强染色体方面的筛查。在出生后早期检出染色体异常对受累新生儿的最佳处理和治疗非常重要。如唐氏综合征早期识别易于实现治疗目标，尤其是控制症状与处理其所致的医学疾病。精神疾病的早期诊断与早期干预改善了伴有精神分裂症与双相性精神障碍个体的长期预后。新生儿时期早期诊断的意义首先对患儿出现的各种异常现象可知原因，以及给予合适的对症处理方法。另外告知家属对下一胎的三级预防，针对性地通过孕前、孕期和新生儿体检及实验室检查，达到最大程度的预防。其中一级预防和二级预防至关重要^[10,11]。

目前Array－CGH已在肿瘤基因组学和人类遗传性疾病的诊断中起重要作用，对于胎儿的产前诊断及出生缺陷的筛查具有重要意义。Array－CGH作为一种新的分子生物遗传学检测手段，可一次性快速、综合、全面地分析基因组，从而发现染色体缺失、重组及拷贝异常^[12]，在临床上开展和应用可为临床诊断带来巨大改革。有研究认为Array－CGH有可能成为围产期染色体异常的一级诊断措施^[13]。本研究通过Array－CGH对新生儿染色体疾病的检测，大大提高了临床疾病的早期诊断率，对临床一些不具有典型临床特征的病例能够在早期准确认识并给予适当治疗。Array－CGH检测技术在新生儿早期诊断染色体疾病中具有重要意义^[14]。将在生殖发育的基础和临床研究中发挥作用。但是为尽量减少临床假阳性和假阴性结果的出现，尚需对各项技术指标和操作规程进行优化。

引用本文

引用本文: 姜敏, 钟雁, 齐宇洁, 等.  微阵列比较基因组杂交检测在新生儿染色体异常疾病筛查中的应用 [J] . 中华新生儿科杂志,2017,32 (2): 119-122. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2096-2932.2017.02.010

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