文章来源：中华神经科杂志, 2024, 57(1): 5-9.
作者：焦可馨 赵重波
摘要
重症肌无力（MG）是一种由自身抗体介导的累及神经肌肉接头的自身免疫性疾病，致病性自身抗体的检测对其诊断以及病情判断至关重要。商业检测机构和医院常用放射免疫沉淀法、酶联免疫吸附法或细胞免疫荧光法检测MG患者的血清抗体，但在敏感度和特异度方面存在不少问题，同时缺乏高级别循证医学的直接比较研究。近期SCREAM研究的发布用中国人的数据证实了细胞免疫荧光法的优势，为MG实验室诊断的优选推荐提供了Ⅰ级证据，填补了国内外空白。然而，上述检测方法所获得的结果均难以用于患者的纵向比较，并不能作为关联病情的最佳生物标志物。文中同时结合近些年对MG致病性自身抗体的认识进展尝试讨论这个问题，并对未来的发展进行展望。
重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种由自身抗体介导、影响神经-肌肉接头传递的自身免疫性疾病，临床上以波动性骨骼肌无力为主要特点。通过特定检测手段鉴定自身致病性抗体对疾病的诊断至关重要，同时也为基于血清抗体分型的“个性化”治疗策略提供了指导。在过去几十年中，国内外学者已经对放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）、酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和基于细胞底物的实验法（cell-based assay，CBA）用于检测乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AChR）和肌肉特异性酪氨酸激酶（muscle-specific tyrosine kinase，MuSK）抗体的诊断准确性进行了多项研究。然而，这些研究受到样本量小、单中心和非盲法设计的限制，使其在诊断敏感度和特异度方面存在显著的变异性。因此，关于检测AChR和MuSK抗体的优选诊断方法尚无统一共识。
近期，天津医科大学总医院施福东教授团队牵头中国多家中心进行了一项多中心、双盲、前瞻性队列研究（the Specificity，Sensitivity and Clinical Correlation of CBA，CBA-TSA，RIPA and ELISA Assay in Detecting AChR and MuSK IgG，SCREAM），比较了固定法CBA、RIPA和ELISA在MG诊断中检测AChR和MuSK抗体的敏感度和特异度，其成果发表在 The Lancet Regional Health-Western Pacific杂志上，为MG的致病性抗体检测领域提供了高级别循证医学证据 ［ 1 ］ 。文中就MG血清致病性自身抗体的认识进展和诊断技术进行评述。
一、MG致病性自身抗体的病理机制
人类的骨骼肌烟碱样AChR受体有成人型（α2βδε）和胎儿型（α2βδγ）2种异构体，当运动神经末梢释放的乙酰胆碱与受体结合后会引起钠离子通道开放，引起能启动肌细胞兴奋-收缩偶联的动作电位。多数AChR的自身抗体为IgG1或IgG3亚型，与α1亚单位的胞外段相结合，主要通过3种不同的分子机制介导突触后膜的病理损伤 ［ 2 , 3 ］ ：（1）激活补体介导的结构损伤（激活补体型）：在患者的突触后膜上可检测到由自身抗体和补体组成的免疫复合物沉积，通过超微结构观察可见AChR丢失和突触间隙扩大，终板电位波幅下降。（2）阻断AChR上的乙酰胆碱结合位点（阻断型）：一些AChR自身抗体可结合于乙酰胆碱的结合位点或附近，阻断离子通道的开放。（3）对AChR表面进行抗原调节（调节型）：IgG1和IgG3亚型的AChR自身抗体为二价，可以通过与受体交联加速其内吞和溶酶体降解，从而减少AChR的数量。补体激活和抗原调节机制还可使包括rapsyn、utrophin和Na +电压门控通道在内的AChR相关蛋白丢失，进一步损害突触后膜 ［ 2 ］ 。
MuSK是一种受体酪氨酸激酶，选择性表达于神经肌肉接头突触后膜，与神经源性聚集蛋白（neurogenic aggregin，Agrin）、低密度脂蛋白相关蛋白4（low density lipoprotein-associated protein 4，LRP4）和对接蛋白7（docking protein 7，DOK7）形成Agrin-LRP4-MuSK-DOK7蛋白轴，对AChR在突触后膜的聚集锚定以及维持膜稳态等方面有重要作用。MuSK的自身抗体为IgG4亚型，不激活补体，主要通过与MuSK的N端免疫球蛋白样1结构域结合，阻断LRP4和MuSK的相互作用，导致MuSK的激活和磷酸化障碍，持续丧失MuSK信号会导致突触后膜AChR簇集的解聚和突触解体，损害神经肌肉接头的传递。IgG4可与其他特异性IgG4发生Fab臂交换，由此产生双特异性的IgG4分子，以单价方式与其抗原相互作用 ［ 3 ］ ，降低其结合能力。当予以静脉注射人体免疫球蛋白治疗时，外源性IgG不容易与IgG4形成抗原抗体复合物而将其中和清除，因此疗效欠佳。然而，为何具有较弱抗原结合能力的单价IgG4会对MuSK产生明显影响，其具体机制尚未明了。
LRP4同属于Agrin-LRP4-MuSK-DOK7蛋白轴，与Agrin结合后形成二聚体，进一步激活MuSK。LRP4的自身抗体主要为IgG1型，体外研究表明能阻碍Agrin和LRP4之间的相互作用 ［ 4 , 5 ］ ，抑制Agrin诱导的小鼠成肌细胞肌管中的AChR聚集 ［ 5 , 6 ］ 。小鼠身体局部注射来自大鼠的LRP4细胞外结构域，可出现肌无力症状并在注射局部发现AChR簇集的碎片化，同时伴有微小终板电位和终板电位变小 ［ 7 ］ 。此外，通过从LRP4主动免疫的兔子中提取IgG并被动转移给小鼠，能“复刻”出MG的临床表型和AChR簇集的病理改变 ［ 3 ］ 。然而，迄今为止尚无将LRP4抗体阳性的MG（LRP4-MG）患者的自身抗体进行被动转移的研究报道。
二、致病性自身抗体作为生物标志的重要性
由于MG的自身致病性抗体不断被鉴定发现，其诊断已进入基于血清学抗体分类的“精准诊断”时代。不同致病性抗体的MG亚型在临床表型和治疗反应上有所差别，对诊断和治疗决策有重要影响。约85%的全身型和50%~60%的眼肌型MG患者血清AChR抗体阳性，AChR抗体阴性的患者中有30%~60%存在MuSK抗体阳性，抗体双阴性的MG患者中约有19%存在LRP4抗体阳性 ［ 8 , 9 ］ 。然而，LRP4抗体的特异度不如前两者，分别可在8%AChR抗体阳性的MG（AChR-MG）、15%MuSK抗体阳性的MG（MuSK-MG）以及4%的其他神经免疫病患者血清中检测到 ［ 10 ］ 。此外，有研究结果表明10%~23%的肌萎缩侧索硬化患者血清中也能检测到LRP4抗体 ［ 11 ］ 。鉴于LRP4抗体的特异度不够高，尽管有体外和动物研究的致病性证据，近些年的REGAIN、ADAPT、RAISE以及MyCarinG等临床试验均未纳入LRP4-MG作为研究对象 ［ 12 , 13 , 14 , 15 ］ 。
AChR-MG可伴有胸腺瘤或胸腺增生，早发型以女性多见，晚发型以男性多见，对免疫治疗反应不一，对伴有胸腺瘤者实施手术治疗为A级推荐 ［ 16 ］ ，对非胸腺瘤的全身型患者也可考虑实施胸腺切除治疗以改善病情并减少合并使用糖皮质激素的剂量 ［ 17 ］ 。此外，近几年针对补体C5和新生儿Fc受体（neonatal Fc receptor，FcRn）的生物靶向治疗均以AChR-MG为对象获得了明显疗效 ［ 12 , 13 , 14 , 15 ］ 。MuSK-MG发病年龄不定，胸腺正常，单纯眼肌型少见，以延髓肌和中轴肌受累为主，对传统免疫治疗和静脉注射人体免疫球蛋白反应欠佳，但对B细胞删除治疗反应较好 ［ 18 ］ 。从LRP4所在Agrin-LRP4- MuSK-DOK7蛋白轴的位置而言，理论上推导LRP4抗体如果有致病性，其所致的临床表型应该与MuSK接近，但事实并非如此。LRP4-MG患者发病年龄不定，女性多见，胸腺正常，总体症状相对较轻，一般认为其对免疫治疗反应较好 ［ 19 ］ 。因此，基于自身致病性抗体类型有助于对患者制定相对个性化的治疗策略。
一直以来，国内外学者曾尝试将AChR抗体的水平作为疾病严重程度或预测干预治疗效果的标志，但一直未能如愿。虽然眼肌型MG患者的AChR抗体滴度通常低于全身型患者，但血清抗体滴度与MG的严重程度之间没有绝对的相关性 ［ 4 ］ 。Sanders等 ［ 20 ］ 的研究结果表明，AChR抗体水平的下降与临床病情的改善只有弱相关性，其阳性预测值为83%，阴性预测值仅为59%。
然而，也有一些间接证据表明抗体水平与疾病进展、严重程度和治疗反应相关。Peeler等 ［ 21 ］ 通过一项基于眼肌型MG患者的回顾性研究发现，发展为全身型MG者的平均AChR抗体水平显著高于未发展为全身型者，但仅为趋势，不能界定出一个预测值。Kojima等 ［ 22 ］ 采用调整后的AChR抗体水平的每日降低率（RR-AChR Ab，% /d）来预测MG患者的治疗预后，其计算公式=（治疗前AChR 抗体水平-治疗后AChR抗体水平） /治疗前AChR抗体水平 /从治疗开始至重新检测AChR抗体水平之间的天数×100%。该研究结果显示，RR-AChR Ab高的患者与治疗后1年的良好预后有关。近期的一项盲法回顾性队列研究也表明AChR抗体血清水平的升高和降低分别与MG患者临床状况的严重和轻微相关，对MG患者的随访有价值 ［ 23 ］ 。
AChR抗体水平不能反映病情的原因较为复杂且未完全明了，主要推测与以下因素有关：（1）同一例患者体内可能存在发挥前述3种致病机制的多克隆抗体，多个AChR特异性克隆的组合可以协同作用，增强致病效应 ［ 24 ］ 。（2）AChR亚单位和抗原表位是多样的，可位于突触后膜和离子通道的不同部位，针对不同抗原位点的自身抗体所产生的致病性可能会有所差别，因而检测到的抗体水平不能与致病性相匹配 ［ 25 ］ 。（3）单克隆的AChR抗体可能同时具有前述3种致病机制 ［ 25 ］ ，这使得患者血清中抗体的致病性更加难以定量。（4）存在非致病性AChR抗体。Maddison等 ［ 26 ］ 在5例非MG患者血清中通过放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）检测到AChR抗体，但改用CBA检测结果却为阴性，推测这些通过RIA检测到的抗体仅针对AChR的胞内段抗原，没有致病性。在临床实践中，血清中AChR自身抗体的检测不能对激活补体型、调节型和阻断型3种致病机制的抗体克隆进行甄别，也不能对多个克隆间的相互叠加作用予以定量，所以无法真实反映抗体的总体致病性。
由此可见，对AChR抗体的定性和致病性定量不应该再是传统的单一维度，而应同时考虑抗体的轻链/重链 CDR3基因序列、抗原表位和结合模式，建立一个综合参数，或许才能真正作为预测患者病情的生物标志物。
三、血清致病性自身抗体的检测方法及其局限性
目前MG血清自身抗体的检测方法包括RIPA、ELISA和CBA。RIPA在各类研究中最为常用，以检测AChR抗体为例，是使用等量表达胚胎型和成人型AChR的人肌细胞系TE671细胞提取物或人类截肢肌肉提取物作为抗原，通过 125碘-α-银环蛇毒素（ 125I-α-BuTx）标记AChR，用羊抗人IgG血清沉淀抗原抗体复合物 ［ 27 ］ 。RIPA的特异度高达99%，全身型MG的敏感度为85%，眼肌型为50% ［ 28 , 29 ］ 。ELISA在临床检测中常用，使用高度选择性与AChR结合的α-银环蛇毒素包被固相载体，加入含AChR的骨骼肌提取物，再测定待测血清中的抗AChR抗体。这种方法简便易行且可以避免应用放射性物质，便于推广，但其敏感度和特异度均不及RIPA ［ 27 ］ 。
CBA是更为灵敏的一种检测方法，它以人类胚胎肾活细胞为检测对象，能更好地模拟AChR的自然状态，具有非常高的特异性，可以检测到亲和力较低的抗体。在RIPA测定血清AChR抗体为阴性的患者中，通过CBA可以检测出30%~60%的阳性 ［ 30 ］ 。
RIPA对MuSK抗体检测的特异度接近100%，但在不同研究中的敏感度差异较大。CBA检测的特异度达100%，而敏感度较RIPA高8%~9%，ELISA的敏感度低于RIPA和CBA ［ 30 ］ 。
CBA的检测结果为滴度，不适合用于定量分析。RIPA和ELISA可以产生具体的nmol/L数值（摩尔术语），但由于前述致病性抗体的复杂性，其结果也很难适用于纵向比较。Sanders等 ［ 20 ］ 不建议将商业试剂盒检测的AChR抗体水平作为MG改善的生物标志物。此外，上述3种方法可能由于检测体系中抗原的选择、检测极限的限制、致病抗体的复杂性、检测方法批次间的异质性以及抗体的非特异交叉反应等，会在一定程度上影响检测的准确性 ［ 31 ］ 。
SCREAM研究通过多中心、双盲研究结果表明，在2 043例MG患者的血清样本中，CBA、RIPA和ELISA检测AChR抗体的敏感度分别为72.3%、64.1%和62.7%，特异度分别为97.8%、97.8%和94.8%；检测MuSK抗体的敏感度分别为2.9%、2.4%和2.6%，特异度分别为100%、100%和99.1%。ELISA更容易产生假阳性，在敏感度方面也无优势。而相较于所谓“金标准”的RIPA，固定法CBA可以将AChR抗体检测的阳性率提升8.2%，在RIPA检测阴性的患者中，仍有27.5%的患者AChR抗体为阳性，证实了固定法CBA在检测AChR抗体和MuSK抗体方面具有更好的可靠性和有效性，为MG患者的血清学检测推荐提供了Ⅰ级证据。
四、结语
MG在继药物治疗进入循证医学时代之后，以SCREAM研究的发表作为标志，实验室抗体诊断也进入了循证医学时代，中国学者在其中不断发力，正在发挥越来越多的积极作用。然而，鉴于致病性抗体本身的复杂性，仅在诊断上获得优化的方法学指导是远远不够的，未来如何重新定义致病性抗体的“多维度”和开发新的、能真实反映致病性的检测方法仍任重而道远。
参考文献略
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