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第
19
期
>>>肿瘤新抗原/肿瘤特异性抗原
每周新知
▲上期回顾（点击图片可看大图，下同）
在聊到肿瘤的免疫治疗，一般会出现肿瘤新抗原/新抗原（Neoantigens）的概念，那么肿瘤新抗原到底是指什么呢？肿瘤新抗原与PD-1/PD-L1疗效相关性如何？先来明晰几个概念：
可简单理解为：
肿瘤特异性抗原（tumor specific antigen，TSA）是肿瘤细胞特有或只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞的抗原，包括致瘤病毒整合进基因组产生的抗原和突变蛋白产生的抗原；同时由于是肿瘤细胞新产生的抗原，故而也被称作neo-Ag（Neoantigens）。 neo-Ag为肿瘤细胞所特有，可区分肿瘤细胞和正常细胞，常具有强免疫原性。由于病毒介导的肿瘤仅占所有瘤种的一小部分，所以突变来源的新抗原成为免疫治疗最理想的靶标。目前第三方医学检验所的大Panel或WES产品中推出的新抗原（Neoantigens）或TNB（肿瘤新抗原负荷）则是指突变来源的新抗原。
肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens，TAA）是肿瘤细胞和正常细胞组织均可表达的抗原，只是含量在细胞癌变时明显增高。一般做体检时检测的癌胚抗原（CEA）和肝癌辅助诊断血清标志物甲胎蛋白（AFP）属于此类抗原。
随着TSA和TAA临床研究的不断加深，衍生了肿瘤抗原组概念和肿瘤抗原组学学科。
【肿瘤抗原组（Cancer antigenome）】：
指肿瘤细胞内全部抗原(蛋白类抗原和非蛋白类抗原)的总合。
【肿瘤抗原组学（Cancer antigenomics）】：
主要利用免疫学、抗原表位组学、抗体组学及多系统组学相关高通量技术有效筛选肿瘤相关抗原的一门新兴学科。
【肿瘤抗原组学的技术方案】：
采用异种疫苗免疫技术，先将包含全部肿瘤抗原的肿瘤组织裂解物作为疫苗免疫动物，制备特异性抗体，再通过免疫分离、鉴定技术(免疫亲和层析、免疫沉淀技术、质谱技术)分离、鉴定TAA。
TSA/肿瘤新抗原根据其产生原因可分为4类：
（1）由化学和物理致癌剂诱导的肿瘤抗原，如：甲基胆蒽，紫外线等；
（2）病毒诱导的抗原，如：DNA病毒中的人乳头状瘤病毒、EB病毒、乙肝病毒等；RNA病毒中HTLV-1病毒等；
（3）沉默基因被激活的产物；
（4）突变的原癌基因编码的蛋白，如：突变的ras（原癌基因）基因产物、P53 基因突变产物等。
肿瘤是一种基因病，其在形成、生长和发展过程中积累了很多的突变，许多突变可导致基因组开放阅读框（open reading frame,ORFs）序列的改变：如单核苷酸变异（single nucleotide variant,SNV）所致的错义突变、插入/缺失（In/Del）所致的移码突变、融合、终止密码子丢失等都可能产生新的 ORFs，从而改变氨基酸编码序列，在肿瘤细胞内表达新生突变蛋白。
新生突变蛋白被处理成多肽后，在抗原加工相关转运体及内质网氨基肽酶等物质的参与下，以MHC多肽复合物的形式分布在肿瘤细胞表面，最终有部分突变蛋白可作为Neoantigens被T细胞受体（T cell receptor，TCR）识别并触发免疫应答（见图1）。
图1 新抗原图谱和识别策略概述
（图上半部分：示例性显示HLA I类配体的新抗原来源；图下半部分：用于肿瘤特异性改变的免疫原性评估的分析路径示意图；缩写定义： SNV，单核苷酸变体；In/ Del，插入/删除；MS，质谱；TCR，T细胞受体；HLA，人白细胞抗原；DC，树突状细胞）
早期主要通过cDNA文库筛选新抗原，较为费时费力。随着NGS测序技术和生物信息学的发展、测序成本的下降，使得快速有效地对每位患者进行单独测序和新抗原筛选成为可能，为新抗原疫苗临床应用奠定了基础。目前肿瘤新抗原筛选主要有3种（见图2）：
方法1：
（1）通过全外显子组测序（whole-exome sequencing，WES）对比检测肿瘤组织和相应正常组织的DNA序列，筛选出能够被免疫系统识别的肿瘤特异性突变；
（2）通过RNA测序进一步证实突变位点：发现nsSNVs后，直接合成多个含有突变位点的短基因串联序列（tandem minigene，TMG），然后以负载TMG的质粒为模板直接体外转录合成RNA。
方法2：
（1）通过全外显子组测序（whole-exome sequencing，WES）对比检测肿瘤组织和相应正常组织的DNA序列，筛选出能够被免疫系统识别的肿瘤特异性突变，包括非同义单核苷酸多态性（non-synonymous single nucleotide variants，nsSNVs）、插入/缺失位点及融合基因；
（2）检测患者的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）分型；
（3）根据各突变抗原与HLA各型的亲和力高低对抗原进行排序，选择亲和力高的合成短肽或长肽；抗原肽与HLA的亲和力可以通过软件预测。
方法3：直接通过数据库和文献检索挖掘肿瘤新抗原表位。该方法的独到之处在于可以发现实体瘤的高频突变位点。
方法1~3筛选并合成的突变肽是否具有免疫原性需要通过体外的T细胞反应试验反复确认。具体方法为：用负载有抗原的抗原提呈细胞（antigen-presenting cells，APCs）与患者的T细胞体外共孵育，检测CD4+和 CD8+T细胞的活化标志物，如OX-40、4-1BB、CD170a及γ-干扰素（interferon-gamma，IFN-γ）。目前大部分公司使用方法2进行肿瘤新抗原的预测。
但来自Montréal大学Claude Perreault教授的研究团队于12月5日发表在Science Translational Medicine杂志研究表明：
“在两个鼠癌细胞系和七个人的原发性肿瘤中，共鉴定了40个TSA，其中约90％来自非编码区域（noncoding regions），并且或将被基于标准外显子组的方法遗漏；此外，这些TSA大多数并非来自于突变，而是异常表达的转录物（例如内源性逆转录因子），其可由多种肿瘤类型共享”。今后TSA的研究可能会转向非编码 DNA。
图2 肿瘤新抗原筛选的常用方法
回到文章最初提到的肿瘤新抗原与PD-1/PD-L1疗效相关性如何？
PD-1和PD-L1抗体解除肿瘤细胞对免疫系统的抑制作用后，免疫系统是通过识别肿瘤细胞表面的新抗原来对肿瘤细胞进行杀伤。
在此过程中能让免疫系统起到直接识别作用的是肿瘤新抗原，因此肿瘤细胞的新抗原数量与PD-1/PD-L1抗体的疗效具有相关性。
Rizvi NA, et al研究表明：
对Pembrolizumab持续获益的NSCLC患者，其TNB明显高于与没有持续获益的患者（mTNB 200 VS 83）；且TNB高的患者PFS也明显高于TNB低的患者（mPFS 14.5 months VS 3.5 months）（见图3）。该研究提示了PD-1免疫抑制剂获益患者TNB高，且高TNB的患者较低TNB患者PFS长。
图3 新抗原图谱和识别策略概述
（缩写定义：DCB：durable clinical benefit，持续临床获益；NDB：no durable benefit，没有持续获益）
Yarchoan M, et al.研究发现：
PD-1/PD-L1免疫抑制剂治疗的ORR（客观反应率）与TMB（肿瘤突变负荷）呈明显的正相关 (P<>，相关系数为0.74，表明不同癌症类型中抗PD-1/PDL1治疗的ORR可以用TMB来解释。
Rooney MS, et al.研究发现：
TMB越高，肿瘤部位的局部免疫细胞溶解活性越大。
Schumacher TN, et al.研究表明：
突变可能导致新抗原（Neoantigens）的产生，产生的肿瘤新抗原越多，TNB（肿瘤新抗原负荷）就越高，肿瘤细胞被T细胞识别的机率就越大，进而对肿瘤进行杀伤，使用免疫抑制剂就越容易引起免疫应答。
这些临床研究均表明，T细胞能够有效识别肿瘤新生抗原（Neoantigens）是免疫抑制剂具有疗效的关键因素之一。既往免疫检查点阻断治疗也发现，肿瘤新抗原的负荷越大，PD-1或CTLA-4抗体阻断后的治疗效果越好。这些研究都提示肿瘤新抗原在肿瘤精准免疫治疗中具有非常好的应用前景，值得进行深入的临床治疗性试验研究。
肿瘤新抗原在肿瘤防治中发挥日益重要的作用，因此，筛选、鉴定肿瘤新抗原被认为是实现肿瘤早期生物诊断、生物免疫治疗、抗体药物研发、肿瘤疫苗设计所面临的首要挑战和基础，也是最终根治恶性肿瘤之希望所在。
注：以上内容根据笔者自己的理解进行整理，若有疏漏异议，欢迎大家留言指正。
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