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CCK8系列教程来了。

果子碎碎念

这篇帖子应该是昨天发的,但是高师姐一不小心发给了别人,我也不好意思打扰她,结果到今天早上她才知道,所以今天补发。
高师姐在今天的正文前,讲了一大段对于自己实验思考的话,我觉得很有意思,如果我们仅仅讲技术,那还不如直接去网上检索protocol来得直接。
以下是高师姐的正文


高师姐的絮叨

昨天预答辩顺利结束,总的来说,还不错。预答辩时遇见一个比较懂的老师,提了几点很好的建议,当有些建议不谋而合后,内心还是有些小确喜的。证明我们关注的东西是一样的。其中就提到说我在用抑制剂后,检测蛋白的相互作用全用WB显示,而没有Co-IP的图片。哎,说起这个就是痛啊,因为内源性的蛋白相互作用真的是不好做啊。就像果子老师昨天说的,做多了后,才发现都是坑。下面跟大家先分享哈这个小故事。

我的实验中三个蛋白的相互作用是功能性的相互作用,结合的时间不长,并且弱,本身就比较难检测到。加上在使用抑制剂后,他们不会有相互作用。我做了至少5次,发现在加了抑制剂后是没有相互作用的。做到这里,大部分的人都会喜大普奔,很开心的下结论,说它们没有相互作用了,证实抑制剂就是抑制它们的相互作用。

但是,但是哈,大家有没有想过,这是实验技术本身的问题,因为不可能有一个抑制剂能100%抑制住,能达到50%或者70%都是非常牛逼了的。那问题来了,就算剩下的相互作用再弱,你也应该检测的到一些些吧。所以最好的状态就是可以检测到下降的趋势,并且有统计学意义,这样比较让Reviewer信服。

我当然不会告诉你们我也会考虑到这些,那肯定有人会问那你怎么不增加蛋白的量呢?你们不会知道我做不加抑制剂时的相互作用,培养了多少细胞。10瓶T175,有没有,有没有,当时收蛋白直接手软到怀疑人生。input都达到了10 mg,真的是极限了。即使这样,我用同样的方法做了三组抑制剂的Co-IP,重复了5次,用了超敏的ECL显影剂,用了P32放射性同位素标记,依然只做出了其中两组,另外有一组死活都做不出来,心好累啊。

那外源性的Co-IP呢?这也有问题。外源性是同时转了3个质粒,病毒感染后,使用抑制剂,在内源性的同一时间检测三个蛋白的相互作用,这个还是比较好做的。但是,你最后的结果跟你的转染效率非常相关,3个质粒单独的转染效率要差不多一样。说句实话,不知道大家有没有遇到,原本你已经把三个质粒的转染效率调得差不多一致了,但是三个一起转了后,就会变得不一样。所以我的外源性的Co-IP虽然趋势都一致吧,但是有时候强,有时候弱。不知道在看这篇文章的你们,有没有什么好的建议啊。大家可以一起分享。

最后,肯定会问,那怎么不用免疫荧光的方法检测三者的相互作用呢?我的情况是这样的,其中一个蛋白在正常的细胞中表达就很少,还主要在胞核中存在,而相互作用的场所在胞浆。一般不刺激是无法用免疫荧光的方法检测到的。而外源性转入一个带GFP或者mCherry的质粒,在三个质粒同时转入时,细胞能量消耗太多,容易死亡。
(果子插一句:看到没,其实很多时候我们考虑了很多事情,但是往往提问者却以为抓到了把柄)
在这里,絮絮叨叨说了这么多,是因为预答辩的时候,我准备回答和请教给我提问的那个老师,但是由于时间不够,没有搞成,所以今天在这里说了那么多。


好了,今天准备跟大家分享CCK-8的相关内容,大概分四-五次分享。今天主要分享CCK-8的原理,用途及常用的公司试剂盒。

CCK-8是什么

在做每个东西之前,都要搞清楚这个东西是什么。CCK-8的英文全称是Cell Counting Kit-8,也就是进行细胞计数的一个盒子。那它的用途也就大致可以猜到,和细胞增殖相关的实验都可以。

CCK-8的原理

在CCK-8试剂盒中,最主要的化学药品是WST-8,化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐。它的核心基团和MTT是一样的,是MTT的升级版本。在电子耦合试剂(也就是细胞是活的,有呼吸,有能量代谢)存在的情况下,可被NAD+氧化还原成为水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan)。活细胞越多,产生的Formazan就越多,颜色也会越深(如图1,来自于Sigma)。
所以粗略的可以认为生成的甲瓒物的颜色的深浅与活细胞的数量成正比。为什么是粗略的呢,因为这里没有考虑到细胞代谢水平的高低,有些细胞在药物处理后,可能活细胞数不变,但是代谢率低了以后,细胞呼吸减弱,NAD+产生减少,测出的Formazan也会减少,所以此时怎么算呢(此时我就比较怀恋中性红了)?当然也有解决的办法,下期给大家介绍。因此可利用这个原理进行细胞增殖和毒性分析,在吸光度为450时检测读数。

CCK-8的用途

1.细胞增殖测定:细胞增殖实验在很多领域都会用到,比如肿瘤相关、损伤后修复等。
2.药物筛选:在测定一个药物的毒性和安全有效浓度时,经常会用到CCK-8。
3.细胞毒性测定:这个可以和各个处理因素对细胞活性和增殖的影响,比如在UV、低氧或者什么化学物品对细胞的影响上。
4.肿瘤药敏试验:这个是用的比较广的,我见过做肿瘤的团队,买CCK-8都是一整箱,一整箱的买,比如果子老师所在的团队,哈哈哈。
5.微生物对细胞的毒性或增殖的实验。

CCK-8盒子的选购

还记得第一次做CCK-8的实验时研究生二年级的时候,当时用的第一个盒子是Sigma的,当时的Sigma-Aldrich就是Sigma-Aldrich,还不是现在的Millipore-Sigma。那个盒子给了我莫大的鼓励,因为在那之前做分子克隆一直都不是很顺利。这个盒子是我的硕士老板从美国带回来的,品质有保证,最后的结果也是很好的。后面在做CCK-8的实验时,我们在有选择的情况下都会买sigma,下图2是sigma官网的截图。其实也不贵,只是到货时间太慢。


再此,给大家分享个小事情,有次,因为实验时间点已经到,但是盒子不够,我们就用了某天的CCK-8试剂盒,最后出来的结果如图3。这个结果是我所不能接受的。后来用Sigma的再重复了一次,如图4,这种有深有浅的才是该有的结果。我想说的是在有能力选择范围内,尽量选择好一点的试剂,免得浪费时间。


后来博士换了导师,换了课题,没有再用Sigma的了,用了一个日本的牌子,名字和货号如下,结果只能说just soso,肯定没有Sigma的好用。

果子老师他们常用MCE的,不知道使用体验怎么样啊?
好了,今天就分享到这里,我们下周见。
最后,来张我种的玫瑰花,恰好今天早晨开放,希望大家的心情犹如玫瑰。
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