在操作过程中, 通常可同时观察可溶性 p62 蛋白、不可溶性 p62 蛋白和 LC3B-I/II 转化综合判断自噬流状态。
若是可溶性 p62 蛋白减少, 不可溶性 p62无明显改变, 同时 LC3B-I 向 LC3B-II 转化增加则表明自噬流活化;
若观察到可溶性 p62 蛋白减少, 但不可溶性 p62 明显增加, 则无论 LC3B 是否发生 I 型向II 型的转化均代表了自噬流阻断;
即使可溶性 p62 蛋白水平降低, 不可溶性 p62 无明显改变, 但 LC3B 没有发生 I 型向 II 型的转化, 也不能说明自噬流一定活化。
获取不可溶性 p62 的方法主要是在常规细胞裂解离心后, 向离心沉淀中加入高浓度尿素或盐酸胍, 使形成包涵体的不可溶性p62溶解, 随后便可使用常规蛋白质电泳进行检测。
需要注意的是, 当自噬流出现波动时可溶性及不可溶性p62的变化具有一定的滞后性,这也为其检测造成了一定困难。
LC3B在自噬流出现活化或抑制时, 其蛋白水平改变较为迅速, 而作为自噬底物, p62降解所需时间则较长。
在检测过程中设定不同的时间点可以动态分析 p62 的变化。假定经过药物处理后6 h 或 24 h 能够观察到 LC3B 蛋白水平变化, 则 p62的蛋白水平改变可能需要等到 24 h 或 48 h 才会出现,但也有可能与 LC3B 同时出现改变。
另一种检测 p62 的方法是在使用或不使用自噬抑制剂的情况下通过免疫染色进行分析, 这样做可以观察到弥散型 p62 和聚集型 p62 的分布。
目前通过检测 p62 判断自噬流最为准确的方法是联合 Westernblot 和免疫染色技术, 包括免疫组化和免疫荧光。一方面可以检测到细胞内p62不同形态的含量变化, 另一方面可以观察不同形式 p62 在细胞内的定位。
总体来说, LC3B-II的增加与p62的降低并不具有一致性,要想正确评价自噬流受阻或自噬系统受损应当检测LC3B的转化,也要检测可溶性和不可溶性 p62 的变化。
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