新型免疫治疗靶点COP1有望应用于三阴乳腺癌

文献来源：Wang, Xiaoqing, et al. 'In vivo CRISPR screens identify the E3 ligase Cop1 as a modulator of macrophage infiltration and cancer immunotherapy target.' Cell (2021). 184(21), 5357-5374. PMID: 34582788

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摘要

尽管免疫检查点阻断疗法（ICB）在肿瘤临床治疗中取得了显著疗效，但在三阴乳腺癌（TNBC）中的治疗效果极为有限。

本文利用体内CRISPR敲除筛选技术和同源TNBC小鼠模型，发现：肿瘤细胞中E3泛素连接酶Cop1的缺失可以减少巨噬细胞相关趋化因子的分泌，减少肿瘤中巨噬细胞的浸润，增强抗肿瘤免疫及ICB响应性。

转录组-表观组-蛋白组联合分析发现：Cop1通过蛋白酶体降解C/ebpδ蛋白而发挥作用。其中，Cop1的底物Trib2介导了Cop1与C/ebpδ的互作，导致C/ebpδ多聚泛素化。相应地，在肿瘤细胞中敲除Cop1可以稳定C/ebpδ，从而抑制巨噬细胞相关趋化因子的表达。

因此，基于其对肿瘤微环境中趋化因子表达及巨噬细胞浸润的调控作用，Cop1有望作为提高TNBC的ICB治疗效果的潜在治疗靶点。

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基于CRISPR-Cas9技术的基因组功能筛选同源TNBC小鼠模型中潜在的ICB疗法靶点

研究背景

科学问题：2019年FDA批准阿替利珠单抗（抗PD-L1单抗）与白蛋白紫杉醇联合治疗转移性TNBC。尽管这一进展证明了ICB在乳腺癌治疗中的前景，但仅一小部分乳腺癌患者能从中获益。因此，迫切需要寻找有效的靶点来提高ICB治疗TNBC的疗效。

逻辑基础：1. CRISPR-Cas9基因组功能筛选是一种有效的寻找抗肿瘤靶点的无偏性方法。2. 在肿瘤微环境中，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是促进肿瘤进展及转移的主要免疫细胞亚群之一。在多种肿瘤（包括乳腺癌）组织中，TAM的浸润程度越高，患者预后越差。

科学假说：可采用基于CRISPR-Cas9技术的基因组功能筛选方法，在同源TNBC小鼠模型中寻找潜在的ICB疗法靶点。

研究思路

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研究结果

1、使用MusCK文库体内初筛免疫逃逸靶点

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图1.IFN信号在三阴乳腺癌中具有免疫应答作用

研究者首先利用CRISPR-Cas9文库基因组筛选技术，在TNBC小鼠细胞系4T1中分别敲除4500个基因，再将细胞注射到对照组小鼠（BALB/c）、T细胞缺陷的裸鼠（BALB/c Foxn1^nu/nu）和卵白蛋白（Ova）预免疫的小鼠（BALB/c Ova i.p.）中，16天后测量肿瘤体积和肿瘤重量。与预想一致，裸鼠的肿瘤最大，预先免疫Ova的小鼠上的肿瘤最小。

接着，研究者利用他们前期研发的MAGeCKFlute¹分析了敲除后可显著影响抗肿瘤免疫的基因，发现相较裸鼠组，IFNγ信号通路相关基因（Jak1, Jak2, Stat1, Irf1）在对照组中明显减少。研究者为了进一步验证这个发现，以1：1比例(即mCherry:EGFP的比例)混合了Jak1或者Stat1敲除和对照Rosa26细胞注入裸鼠和敲除小鼠，16天后进行流式分析，发现mCherry阳性细胞在对照组小鼠中确实显著减少，说明IFN信号在TNBC中具有抑制免疫应答的作用。

2、二次MusCK文库筛选鉴定出TNBC调节基因Cop1

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图2.敲除Cop1可影响小鼠生存率

为了使鉴定出的候选基因更准确可信，研究者从初筛的基因中选择了79个差异最明显的基因，针对每个基因制备了8个sgRNA进行二次筛选，并再增加了一组：联合给予Ova与PD-1单抗的受体小鼠(BLAB/c Ova anti-PD-1)。

将不同组与裸鼠组对比后，研究者发现敲除IFNγ相关基因、CD274（Pd1）、原癌基因Trim24以及E3泛素酶Cop1均可显著改善免疫应答。在这两次筛选中，Cop1均脱颖而出，并且以前未有报道其抗肿瘤免疫的作用，因此本文研究者决定着重探究Cop1在TNBC免疫治疗中的作用。

研究者首先敲除了肿瘤细胞系中的Cop1，但发现肿瘤生长未受影响。他们随后将敲除Cop1的肿瘤细胞移植到不同受体小鼠中，发现免疫功能正常小鼠生存得更久，而裸鼠生存期更短。这进一步提示了Cop1在肿瘤免疫治疗过程中潜在的功能。

3、Cop1调控TNBC巨噬细胞相关趋化因子

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图3. Cop1可以调控巨噬细胞趋化因子的表达来参与抗肿瘤免疫

随后，研究者探究了Cop1在抗肿瘤免疫中的功能。他们首先通过RNA-seq分析比对IFNγ处理下野生型和敲除Cop1的细胞系的信号通路变化，发现敲除Cop1的细胞巨噬细胞激活信号和巨噬细胞趋化因子显著降低。细胞因子检测实验也验证了这一分析结果。

随后研究者利用流式分选比对了CD11b Ly6C^-Ly6G^low巨噬细胞数量，发现敲除Cop1显著减轻了巨噬细胞浸润。进一步的单细胞测序分析结果显示，敲除Cop1可以减少类似M2表型的TAM而增加类似M1表型的肿瘤杀伤性巨噬细胞。以上结果说明Cop1可以调控巨噬细胞趋化因子的表达来参与抗肿瘤免疫。

4. Cop1调控C/ebpδ表达

点击查看大图图4. C/ebpδ是Cop1免疫调节功能的关键分子

接下来研究者开始寻找Cop1的底物。由于Cop1的底物大多数是转录因子（TF），所以他们利用以前开发的LISA系统²并结合RNA-seq的数据来预测可能的TF，结果显示CEBP、AP1和ETS家族可能是Cop1调控的TF。

随后，研究者采用ATAC-seq技术，将敲除Cop1样本中结合位点跟已知的TF结合motif对比，发现AP1和CEBP家族可能是Cop1的底物，且Cop1敲除后C/ebpδ的表达确实升高了（此处省略他们筛选CEBP家族蛋白的过程，请见原文）。最后他们将敲除Cop1、C/ebpδ以及双敲这2个基因的4T1接种到小鼠上，证实了Cop1敲除导致的抗肿瘤免疫应答激活效应会被C/ebpδ的敲除所抵消。这些结果说明C/ebpδ确实受Cop1调控，并且是Cop1免疫调节功能的关键分子。

5. C/ebpδ抑制巨噬细胞趋化因子表达

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图5. 转录因子C/ebpδ可以负调控巨噬细胞趋化因子的表达

接着，研究者基于之前开发的工具Cistrome-GO³分析了Chip-seq、ATAC-seq和RNA-seq的数据，寻找Cop1敲除后下调的基因哪些具有C/ebpδ结合位点，发现了Ccl2和Ccl7这两个巨噬细胞趋化因子。紧接着，研究者又对敲除C/ebpδ的细胞进行了RNA-seq，并与敲除Cop1的RNA-seq数据进行交互分析，发现敲除C/ebpδ与敲除Cop1对巨噬细胞趋化因子的影响呈现负相关关系。最后他们通过基因富集分析发现，敲除C/ebpδ后上调的信号通路跟敲除Cop1后下调的信号通路类似。以上结果说明转录因子C/ebpδ可以负调控巨噬细胞趋化因子的表达。

6. Cop1通过Trib2直接靶向C/ebpδ

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图6. Cop1在Trib2的协助下调控C/ebpδ的表达

为寻找Cop1的底物，研究者利用机器学习，尝试在敲除Cop1后上调的蛋白中寻找哪些蛋白具有Cop1的degron motif。出人意料的是， C/ebpδ不在其中。因此，研究者推测C/ebpδ可能不是Cop1直接结合的底物。

在这些预测的底物中，Trib2进入了研究者的视野。在AML细胞系中，Trib2可以作为辅助蛋白协助Cop1泛素化C/ebpα。

因此研究者猜测，在4T1细胞中Cop1是通过Trib2来泛素化C/ebpδ的。为了验证这一猜想，作者进行了一系列免疫印迹实验。首先，免疫共沉淀结果表明Cop1的确可以与Trib2、C/ebpδ结合为复合物。其次，Cop1敲除提高了Trib2的蛋白表达，但没有影响mRNA水平。最后，Trib2敲除同样可以提高C/ebpδ的表达。以上结果验证了Cop1在Trib2的协助下调控C/ebpδ的表达。

结论

本文研究者利用CRISPR敲除筛选技术，在同源移植肿瘤小鼠模型上探寻参与肿瘤免疫调控的靶点基因，鉴定出TNBC上的Cop1可以提高巨噬细胞趋化因子的表达来增加TAM的浸润。进一步分析发现Cop1是在Trib2的协助下泛素化转录因子C/ebpδ来影响巨噬细胞趋化因子表达的。

编者点评

本文研究者主要利用了TNBC的4T1同源移植模型做CRISPR敲除筛选免疫应答的调控靶点，该方法也可以推广到其他体内肿瘤模型。同时该团队巧妙地将先前研发的多项计算生物学分析工具应用到了此项研究中，为自己过去的研究成果做了一个免费且响亮的广告，小师弟对此颇为佩服。同时也希望这篇文章所用到的生信分析工具可以给我们广大读者的研究提供一定的帮助。

思维发散

1. 本文认为Cop1主要是通过调节巨噬细胞趋化因子来调控免疫应答的，但是趋化因子不仅募集巨噬细胞（如Ccl2同样会趋化中性粒细胞和淋巴细胞等免疫细胞）。此外，Cop1也表达在免疫细胞上。未来如果研发出Cop1抑制剂作为治疗药物，其可能会直接作用于免疫细胞上的Cop1而影响免疫应答。

2. 在本文分析TF的时候，还识别到了AP1等其他家族，那么这些TF是否也参与Cop1对免疫应答的调控？

参考文献

1. Wang, Binbin, et al. 'Integrative analysis of pooled CRISPR genetic screens using MAGeCKFlute.' Nature protocols 14.3 (2019): 756-780.

2. Qin, Qian, et al. 'Lisa: inferring transcriptional regulators through integrative modeling of public chromatin accessibility and ChIP-seq data.' Genome biology 21.1 (2020): 1-14.

3. Li, Shaojuan, et al. 'Cistrome-GO: a web server for functional enrichment analysis of transcription factor ChIP-seq peaks.' Nucleic acids research 47.W1 (2019): W206-W211.

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注：详细信息请参见原文！

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867421010539

责任编辑：小白

美术编辑：兔子

终审发布：箫砚、浑水摸鱼的大师姐