PD-L1在人类肿瘤中频繁表达，与免疫细胞上的PD-1共同作用，有助于肿瘤免疫逃逸。因此，阻断PD-1/PD-L1相互作用的抗体重新激活细胞毒性T细胞，从而消灭癌细胞。然而，大多数癌症患者对PD-1/PD-L1阻断剂没有反应，其潜在机制尚不清楚。最近的研究表明，肿瘤细胞上PD-L1的表达水平可能影响抗PD-1/PD-L1治疗的临床疗效。因此，了解调控PD-L1基因表达的分子机制对于提高PD-1/PD-L1阻断的临床反应率和疗效具有重要意义。本文主要关注PD-L1的调控及其在调节抗肿瘤免疫反应中的潜在作用，旨在优化抗PD-1/PD-L1的治疗方法，使更多的癌症患者受益。
1、癌症免疫治疗的研究进展
尽管包括化疗和放疗在内的传统疗法被用作大多数人类癌症患者的第一线疗法，但最近癌症免疫疗法方面的新进展已将癌症治疗的前景从传统疗法的补充要素转变为中心和标准的癌症治疗方案 [1,2]。在过去的几十年里，免疫疗法或生物疗法，如供体T细胞的被动免疫，利用具有免疫调节特性的免疫佐剂或细胞因子，癌症疫苗，嵌合抗原受体(CARS)修饰的T细胞，以及免疫检查点阻遏剂抗体都是治疗各种形式的人类癌症的有效方法 [2,3]。然而，在这些癌症免疫疗法中，免疫检查点阻遏剂如阻遏细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抗体和程序性死亡1/程序性死亡配体1(PD-1/PD-L1)的抗体已引人注目，并正在癌症治疗领域发生革命性变化。因此，相信免疫检查点阻遏剂策略将深刻地改变基础和临床癌症研究的方向 [4,5]。与直接针对癌细胞的传统疗法不同，抗CTLA-4或抗PD-1/PD-L1抗体可重新激活患者的免疫系统以根除肿瘤，从而诱导多种癌症患者具有持续和持久的抗肿瘤免疫能力 [6,7]。
CTLA-4是在活化的T细胞上表达的一种共抑制受体，抑制T细胞的增殖和活化，部分是通过与其与CD 80(亦称B7-1)和CD 86(亦称B7-2)结合的T细胞共刺激受体CD 28的同源物竞争而实现的[8]。由JamesP.Allison博士领导的研究小组开创了CTLA-4的研究领域，并且是第一个提出研制CTLA-4阻遏抗体可能激活T细胞增殖并增强其生理功能的理论[8]。随后，来自Allison小组的重大的临床前研究表明，使用CTLA-4阻遏抗体的检查点阻断可导致小鼠肿瘤模型的持久消退和持久的免疫反应，从而导致抗CTLA-4阻遏抗体用于人类肿瘤治疗的临床开发和评价 [9]。2011年美国FDA批准的抗CTLA-4阻遏剂抗体iPilimumab的临床试验的成功，为癌症免疫治疗领域开辟了一个新的时代[10]。临床研究表明，iPilimumab阻断CTLA-4免疫点，使部分晚期转移性黑色素瘤患者的总体生存率显著提高[10]。然而，为了解决与抗-CTLA-4治疗有关的相对低应答和频发毒性，包括皮炎、肝炎和小肠结肠炎[11]，需要进一步研究，以确定哪些生物标记物最适合于接受抗-CTLA-4免疫治疗。
PD-1是另一种表达在免疫细胞上的共抑制受体，包括T细胞、B细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞(NK)和肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)[12,13]。据报道，PD-1有两个配体，PD-L1(也称为CD 274或B7-H1)和PD-L2(CD 273或B7-DC)[14,15]。鉴于PD-L1在正常细胞和肿瘤细胞中的表达比PD-L2更广泛，因此更多的研究集中在PD-1/PD-L1参与的生理和病理功能以及如何干扰它们之间的相互作用以进行肿瘤治疗[12]。PD-L1在肿瘤细胞上的高表达是常见的，其中PD-L1与PD-1在T细胞上的结合随后导致T细胞功能障碍和衰竭，从而阻止细胞毒性T细胞有效地靶向肿瘤细胞(图1)。因此，设计和开发PD-1/PD-L1阻遏抗体来阻断PD-1/PD-L1相互作用以重新激活T细胞功能去根除肿瘤细胞(图1)[5]。此外，临床研究表明，肿瘤微环境中肿瘤细胞PD-L1的表达与抗PD-1/PD-L1治疗的应答率呈正相关，这可能是一种潜在的、但不是完美的患者分层的选择标记物[16,17]。因此，有必要充分了解调控PD-L1在肿瘤细胞上表达的上游途径，这可能有助于设计新的调控PD-L1表达的策略，以提高临床应答率和免疫治疗效果。
当PD-L1+肿瘤细胞与PD-1+T细胞结合时，这种相互作用导致T细胞功能障碍，缺乏抗肿瘤活性。然而，利用抗PD-1或PD-L1抗体阻断PD-1与PD-L1的相互作用，可以激活T细胞，释放其抗肿瘤活性。T细胞与肿瘤细胞之间的抑制标志(？)表示活化的T细胞具有抗肿瘤活性。左边面板上的红色X符号代表T细胞功能障碍和缺乏抗肿瘤活性。MHC，主要组织相容性复合体；PD-1，程序性死亡1；PD-L1，程序性死亡配体1；TCR，T细胞受体。
本文从多个方面综述了PD-L1调控的生化研究进展，并对其在肿瘤治疗中的潜在治疗作用进行了综述。我们还讨论了如何通过调控PD-L1的表达来进一步提高肿瘤免疫治疗的临床反应率和疗效。
2、PD-L1基因改变和表观遗传修饰对肿瘤免疫治疗的调控作用
遗传学和表观遗传学的改变在调节癌症进展、免疫监视和肿瘤细胞逃逸方面起着关键作用 [18,19]。针对表观遗传调节器的抑制剂，如DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTi)、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)、溴结构域抑制剂，以及zaster homolog 2抑制剂(EZH2i)增强子或赖氨酸特异性组蛋白去甲基酶1(LSD 1)抑制剂通过增强肿瘤免疫原性、恢复细胞毒性T细胞功能和逆转肿瘤微环境的免疫抑制效应，与PD-1/PD-L1或CTLA-4阻滞剂协同治疗以提高对癌症免疫治疗效果(图2)[19-24]。机制上，这些抑制剂可以激活内源性抗逆转录病毒成分(ERVs)，干扰信号通路，或诱导新抗原的出现，以刺激抗肿瘤免疫 (图 2) [19–24]。此外，最近的研究发现PBRM1和ARID2基因，编码PBAF转换-蔗糖不可发酵(SWI/SNF)染色质重塑复合物的组成部分，通过改变全球肿瘤细胞表达谱，在免疫检查点治疗中发挥关键作用 [25,26]。然而，最近的研究也表明基因组改变和表观遗传途径可以直接控制PD-L1的表达，从而调节癌症免疫治疗的效果(图3, upper panel)。
通过DNMT抑制剂降低DNMT介导的DNA甲基化，或通过LSD 1抑制提高组蛋白H3K4me2和RISC稳定性，通过上调ERV激活干扰素信号通路，导致通过MHC1、免疫原性或细胞因子的产生促进抗原呈递，与免疫检查点(如抗PD-1/PD-L1)协同作用。Dnmt，DNA甲基转移酶；LSD 1，赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1；PD-1，程序性死亡1；PD-L1，程序性死亡配体1；MHC，主要组织相容性复合物；TCR，T细胞受体；RISC，RNA诱导的沉默复合物。
综述了PD-L1基因改变(紫色)、表观遗传修饰(橙色)和微RNA(粉红色)对PD-L1的调控机制，PD-L1，程序性死亡配体1。
2.1、基因组改变调节PD-L1并影响PD-1/PD-L1阻断剂的效果。
一些研究报道，基因组重排，包括染色体9p24.1的基因扩增和易位，导致典型霍奇金淋巴瘤(Chl)[27,28]和原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(Pmbcl)[29,30]中PD-L1和PD-L2的表达上调。重要的是，这些基因组的改变，导致激活JAK2-STAT信号通路，以提高PD-L1转录和蛋白丰度，与相对较高的霍奇金淋巴瘤患者对PD-1阻断的临床反应率相关[27,28,31]。此外，PD-L1、PD-L2和JAK2的扩增在胃癌中也有发现[32]。此外，Kataoka等人发现了一种独特的基因组结构改变，可以通过干扰多种人类癌症[33]中PD-L1的3’-未翻译区域(3’-UTR)来上调PD-L1表达以逃避癌症免疫监测。更重要的是，他们在小鼠肿瘤模型中的发现，他们可以通过证明PD-L1通过3’-UTR缺失上调促进肿瘤生长，逃避细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的免疫监测，而PD-L1抗体可以有效地抑制恢复CD8+CTL。这些发现共同表明上调PD-L1的基因组改变可能作为一个遗传标记来区分哪些癌症患者可能对PD-1/PD-L1免疫检查点阻断治疗有更大的反应。
2.2、PD-L1在抗肿瘤免疫中的表观遗传调控
靶向溴区结构域末端(BET)蛋白的抑制剂（如JQ1和IBET 762）能有效地消除血液系统恶性肿瘤（如急性髓系白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)和淋巴瘤）[34,35]。BET家族的蛋白质通过其溴区结构域与组蛋白中存在的乙酰化赖氨酸基序结合，从而招募转录因子和其他染色质调节因子来促进基因转录[35]。此外，在实体肿瘤中也报道了BET蛋白的存在[36]。最近，两个独立的研究小组发现PD-L1是BRD4的直接转录靶点，朱等人通过筛选一组针对表观遗传调控因子的抑制剂发现BET抑制剂(Beti)能显著抑制PD-L1的表达[37]。他们进一步表明，Beti JQ1通过增强抗肿瘤细胞毒性T细胞的活性，抑制肿瘤细胞、树突状细胞和巨噬细胞上PD-L1的表达，从而延缓肿瘤的进展[37]。另一个由Johnstone领导的小组独立发现BET蛋白抑制剂的抗肿瘤反应需要宿主免疫系统[38]。通过对Beti诱导的转录反应的全基因组分析，PD-L1下调被认为是Myc驱动的B细胞淋巴瘤模型中Beti介导的抗肿瘤作用的主要机制[38]。从机制上讲，他们进一步发现Beti降低了PD-L1位点上BRD 4的占位，导致PD-L1转录抑制，而不依赖转录因子c-Myc。重要的是，他们证明Beti JQ1与抗PD-1抗体协同抑制Myc驱动的淋巴瘤在体内的进展，表明与免疫调节剂联合治疗的Beti药理学疗法可能是一种新的治疗人类癌症的策略[38]。然而，尽管作者也表明PD-L1的持续异位表达降低了JQ1治疗的疗效，但仍需进一步研究耗尽PD-L1并验证JQ1治疗的这些效应是否在很大程度上依赖于PD-L1及其下游靶点。此外，最近的研究表明，表观遗传调控的变化可导致内源性逆转录病毒元件的表达和免疫反应基因途径的极具变化，从而影响抗原提呈和免疫治疗效果(图2)。除了调节PD-L1的表达外，JQ1可能还可能通过这些途径发挥作用。
此外，已有研究表明，在黑色素瘤中，Ⅰ类HDAC抑制剂主要通过增强PD-L1基因的组蛋白乙酰化而上调PD-L1的表达，从而导致PD-L1基因启动子的染色质状态松弛[39]。Lu等人证明组蛋白甲基转移酶(HMTase)MLL1直接结合并催化PD-L1启动子上组蛋白第三亚基四号赖氨酸的三甲基化(H3K4me3)，从而激活胰腺癌细胞PD-L1转录[40]。值得注意的是，他们发现MLL1的药物抑制或沉默降低了PD-L1的表达，从而增强了抗PD-L1/PD-1抗体在小鼠胰腺肿瘤生长模型中的治疗效果[40]。然而，与JQ1治疗一样，MLL 1的抑制也影响许多其他下游靶点，这就需要进一步研究以MLL1为靶点是否是提高检查点免疫治疗胰腺癌疗效的有效途径，部分途径是通过调节PD-L1的表达。
3、PD-L1在转录水平上调节抗肿瘤免疫的作用
越来越多的证据显示，不同的上游信号通路在转录水平上调节PD-L1的表达[41,42]。这些信号通路在很大程度上通过激活几个关键转录因子参与调控PDL 1的表达，这些转录因子直接与PD-L1的启动子区结合，促进PD-L1的表达[41,42]。虽然已有研究表明干扰素γ(IFNγ)信号通路在PD-L1表达的翻译调控和对PD-1/PD-L1阻遏剂的响应中起着最重要的作用，但在不同的细胞或组织环境下，也可以激活其它信号通路来上调PD-L1的表达以逃避抗肿瘤监视。在这里，我们记录了主要的信号通路和转录因子在调控PD-L1表达，通过靶向PD-1/PD-L1来调节免疫监视和癌症免疫治疗中发挥关键作用(图4)。
3.1、IFNγ-JAK-STAT信号通路介导PD-L1的调控
一些研究表明，PD-L1的表达可以被干扰素γ诱导，使肿瘤细胞逃避免疫监视[43-45]。酪氨酸激酶(JAK)和信号转导与转录激活因子(STAT)是通过激活干扰素刺激的反应元件(ISRES)、干扰素γ激活位点(GASS)和干扰素调节因子1(IRF 1)[46]来诱导干扰素的关键。在IFNγ刺激下，JAK-STAT信号可激活IRF1，IRF1直接与PD-L1启动子结合，诱导PD-L1转录，从而抑制抗肿瘤免疫[43-45]。最近的一项研究报道，细胞周期蛋白依赖性激酶5(CDK 5)有助于髓母细胞瘤(MB)逃避免疫监视和抑制抗肿瘤免疫[47]。Dorand等人发现IFNγ诱导的PD-L1上调需要CDK5，而CDK5的缺失导致肿瘤细胞PD-L1表达下调[47]。此外，CDK 5缺失抑制IFNGR信号，部分通过招募IRF1竞争性抑制子IRF2和IRF2BP2来维持PD-L1转录抑制[47]。
肿瘤细胞逃避T细胞的抗肿瘤作用，部分是通过激活不同的上游信号通路，在转录水平上提高PD-L1mRNA的表达。CDK，周期素依赖性激酶；EGF，表皮生长因子；EGFR，表皮生长因子受体；ERK，细胞外信号调节激酶；HIF1，缺氧诱导因子1；HRE，缺氧反应元件；IFNG，干扰素γ；IFNGR，干扰素γ受体；IRF，干扰素调节因子；PD-L1，程序性死亡配体1；PTEN，磷酸酶和紧张素同源物；STAT，信号转导和转录激活因子。
3.2、PD-L1的NF-κB通路调控
NF-κB是一种广泛表达的转录因子，它通过促进细胞存活、增殖、血管生成和转移而被认为是肿瘤发生发展的主要贡献者[48]。NF-κB亚基 RelA/p65和p50的同源二聚或杂二聚导致NF-κB的激活，这是肿瘤细胞逃避适应性免疫所必需的[49]。最近的研究表明，NF-κB信号的激活可上调PD-L1在不同癌症环境下的抗肿瘤免疫抑制作用。在T细胞淋巴瘤中，PD-L1的上调是通过EBV驱动的LMP1信号激活NF-κB所介导的，这与NK/T细胞淋巴瘤不良的预后有关[50]。在卵巢癌中，化疗以NF-κB激活依赖的方式诱导PD-L1的表达，从而提供了一个免疫抑制的肿瘤微环境来逃避免疫监视[51]。此外，在非小细胞肺癌(NSCLC)中，MUC1-C通过增加NF-κB作用于PD-L1启动子上而增加PD-L1的表达，从而诱导PD-L1的转录[52]。
3.3、缺氧诱导PD-L1表达
缺氧是大多数实体肿瘤的共同特征，其严重程度有助于获得肿瘤细胞的恶性特性，如耐药性、转移能力和免疫逃逸[53,54]。转录因子缺氧诱导因子1(HIF-1)通过HIF-1a和HIF-1b[55]两个亚基介导对缺氧的适应性反应。HIF-1a是功能亚基，其稳定性由氧水平以依赖pVHL的方式调节[55]。因此，缺氧条件下HIF-1a表达上调，在肿瘤细胞生存和恶性转化中起着重要作用。有研究表明低氧可诱导肿瘤细胞、髓系抑制细胞(MDSCs)、树突状细胞和巨噬细胞中PD-L1的表达，这些表达主要由HIF-1a[56-58]介导。从机制上讲，HIF-1a与PD-L1近端启动子中的缺氧反应元件(HRE)结合，并诱导PD-L1[59]的转录。因此，低氧条件增加了肿瘤细胞对CTL介导的裂解的抵抗力[56]。选择性阻断HIF-1a在缺氧细胞中的蓄积导致肿瘤细胞PD-L1的表达降低，并导致小鼠的抗肿瘤反应和肿瘤生长减弱[56]。
3.4、PD-L1的c-Myc调控
转录因子c-Myc诱导许多不同功能的基因表达，包括细胞增殖、生长、分化和凋亡[60]。c-Myc基因在许多癌症类型中经常被扩增，c-Myc的上调被认为是促进肿瘤发展的动力之一[60]。c-Myc和其它癌基因在小鼠肿瘤模型中的失活导致肿瘤的完全清除，伴随着CD4+T细胞的募集[61]。近年来的研究表明，PD-L1是c-Myc[62，63]的直接转录靶点。c-Myc在小鼠肿瘤细胞中的失活降低了PD-L1的表达水平，提高了抗肿瘤免疫应答。此外，在c-Myc失活肿瘤中PD-L1的再表达抑制了抗肿瘤免疫。近期研究结果还显示c-Myc在NSCLC患者中的表达与临床预后差之间存在显著相关性[64]。
3.5、MAPK通路对PD表达调控的影响
细胞分裂素激活蛋白激酶(MAPK)信号通路在多种人类癌症类型中常发生突变和过度激活，并显示出有望作为癌症治疗的治疗靶点[65]。MAPK通路主要由细胞外信号调节激酶(ERK)、c-jun氨基末端激酶(JNKs)和p38[65]介导。越来越多的证据表明，这些MAPK致癌信号通路促进肿瘤的发展和免疫治疗耐受[66]。MAPK通路成分的药理抑制作用增强了抗肿瘤反应[66]。此外，MAPK信号通路直接参与调节PD-L1的表达，逃避肿瘤免疫监测。MAPK/ERK通路通过激活转录因子c-jun[67]可提高PD-L1表达。根据这一点，抑制MAPK信号通路导致肿瘤细胞中PD-L1表达水平下降[67,68]。
3.6、PI3K通路在调节PD-L1表达中的作用
导致磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通路的活化的基因改变在许多类型的人类癌症中经常出现[69]。这些改变包括，但不限于，磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)的缺失、PI3K刺激因子和调节亚基、上游激活以因子K-RAS 以及下游效应分子 AKT和PDK1的突变和/或上调，[69]。除了诱导细胞死亡外，PI3K抑制剂还通过刺激T细胞反应或调节髓细胞室而抑制免疫逃逸[70]。PTEN的缺失导致PI3K的激活和PD-L1表达增加，部分通过提高神经胶质瘤和肺鳞癌中PD-L1蛋白的翻译率，从而导致免疫抵抗和逃逸[71,72]。此外，在人黑色素瘤中，PI3K激活还可通过转录因子STAT3诱导[67]表达PD-L1表达。
3.7、PD-L1的EGFR通路调节
表皮生长因子受体(EGFR)作为受体酪氨酸激酶(ERBBS)的表皮生长因子家族之一，在与EGF-家族蛋白的肽生长因子结合后被激活[73]。在不同类型的癌症中，EGFR的异常激活是常见的。肿瘤细胞中EGFR通路的激活导致免疫抑制性肺微环境和通过诱导PD-L1表达而减少对抗PD-1免疫治疗的反应[74]。进一步的研究表明，EGFR途径主要通过IL-6/JAK/STAT 3信号传导轴上调PD-L1的表达，EGFR抑制剂可以降低PD-L1的表达[74,75]。
3.8、Hippo信号在PD-L1表达调控中的作用
Hippo肿瘤抑制通路在各种癌症类型中经常失活[76]。YAP1和TAZ是癌基因，与Tead形成复合物，在细胞增殖、凋亡抑制和上皮-间质转化(EMT)中起重要作用[76,77]。最近的一项研究表明，Hipo通路主要通过LAST1/2激酶抑制抗肿瘤免疫[58]。另外，有两组独立报道YAP1能与PD-L1启动子区结合，诱导PD-L1在肺腺癌和非小细胞肺癌中的表达，以控制免疫逃逸[78,79]。此外，TAZ还能诱导人癌细胞PD-L1在转录水平上的上调，从而抑制肿瘤微环境中T细胞的抗肿瘤活性[80]。
4、通过MicroRNAs调控PD-L1的表达
MicroRNAs(miRNAs)由20-22个核苷酸组成，通过靶向其3'-UTR来调控大量基因，包括抑癌基因和癌基因，以促进mRNA转录本的裂解[81]。最近的研究表明，miRNAs的异常表达在调节癌症进展和免疫检查点阻断介导的癌症治疗中起着重要作用[81,82]。此外，越来越多的证据表明miRNAs直接针对PD-L1 mRNA的3’-UTR，以控制PD-L1的表达和抗肿瘤免疫(图3，下表)。
Chen等人发现microRNA-200(miR-200)是EMT和转移的抑制因子，它直接作用于3'-UTR-PD-L1 mRNA，并抑制PD-L1的表达[83]。他们进一步发现，锌指E-box结合同源异型盒1(ZEB 1)因子，即miR-200的EMT激活剂和转录抑制因子，部分通过抑制CD8+T细胞活性而提高PD-L1的表达和转移[83]。这些结果提示，ZEB 1/miR-200轴介导的PD-L1调控可能是指导抗PD-1/PD-L1阻断治疗方案选择的有用指标。miR-34是p53的下游靶点，它直接与PD-L1-3'-UTR结合，并抑制PD-L1的表达[84]。值得注意的是，作者将miR-34a脂质体(MRX 34)用于同基因小鼠肺癌模型，发现MRX 34单独或联合放疗可显著降低肿瘤细胞上PD-L1的表达，并增强肿瘤微环境中的细胞毒免疫T细胞群[84]。除了在肺癌中的作用外，miR-200C和miR-34a还能靶向PD-L1 mRNA降低AML中PD-L1的表达[85,86]。在胃癌中，miR-152和miR-570可直接结合PD-L1的3'-UTR，抑制PD-L1的表达[87,88]。在胰腺癌中，miR-142-5p通过与其3'-UTR结合而抑制PD-L1的表达，后者通过增加细胞毒性CD4+和CD8+T淋巴细胞而增强抗肿瘤免疫能力[89]。在卵巢癌中，miR-424通过与PD-L1-3'-UTR直接结合并降低PD-L1的表达，从而通过激活T细胞免疫应答来克服化疗抵抗[90]。因此，不同组织中，各种miRNAs可能通过调节PD-L1 mRNA的表达而产生功能上的差异。
5、翻译后修饰对PD-1/PD-L1阻断效应的调节作用
蛋白质翻译后修饰(PTMS)，包括泛素化、磷酸化、糖基化、甲基化和乙酰化，在调节蛋白质活性、稳定性、定位、转运以及与结合伙伴(包括蛋白质、DNA、RNA或脂质)的相互作用方面发挥着关键作用[91]。上面提到的PTMs对于控制各种细胞过程，包括肿瘤形成、转移和抗肿瘤免疫是必不可少的[92,93]。越来越多的证据表明，PD-L1还经历不同的PTMs，影响其稳定性、内化、定位以及生理和病理功能(图5)。
5.1、多泛素化调控PD-L1稳定性以调控抗PD -1治疗效果
泛素-蛋白酶体系统(UPS)促进蛋白质的多泛素化和随后的降解，以控制各种细胞过程和疾病，包括免疫监视和肿瘤发生[94,95]。UPS的降解是由激活酶(E1)、结合酶(E2)和连接酶(E3)三种不同的顺序作用所催化的，这三种酶导致多泛素链共价地附着在目标蛋白的赖氨酸残基上，26S蛋白酶体复合物可以识别这些作用来促进其降解[94]。Li等人表明，基于Cullin 1的泛素E3连接酶转接蛋白β-TRCP通过与PD-L1直接结合，以175 LSGxxTxxxS184基序依赖的方式促进PD-L1的多泛素化和降解，这需要GSK3β介导PD-L1在T180和S184残基上的磷酸化[96]。与这些发现相一致的是，在GSK3β基系中缺少F-box或PD-L1突变β-TRCP显性阴性，抑制了β-TRCP介导的PD-L1多泛素化和降解。Hung团队进一步确认表皮生长因子(EGF)信号是GSK3β/β-TRCP轴的上游调节因子，以调节PD-L1的稳定性[96]。值得注意的是，他们证明，EGFR抑制剂吉非替尼可以通过释放EGF介导的对GSK3β激活的抑制而显著降低乳腺癌细胞PD-L1的表达，从而增加肿瘤浸润CD8+T细胞的活化，并增强PD-1抗体在几种同基因小鼠肿瘤模型中的治疗效果[96]。此外，作者还提到吉非替尼可能为这种联合治疗提供了一些好处，例如减少PD-L1的表达以限制其与T细胞受体的结合，以及限制PD-L1的致癌潜能和降低EGFR过度表达的细胞存活率[96]。
包括泛素化、磷酸化和N-连接糖基化在内的各种PD-L1 PTMs的示意图。
AMPK，AMP激活蛋白激酶；B3GNT3，b-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖苷转移酶；CDK，细胞周期素依赖性激酶；CMTM 6，CKLF样Marvel跨膜区含蛋白6；CR，细胞质区；EGF，表皮生长因子；PD-L1，程序性死亡配体1；SP，信号肽；TM，跨膜。
最近，我们的团队发现PD-L1蛋白丰度在细胞周期中发生波动，进一步证实细胞周期激酶cyclinD-CDK 4活性在PD-L1的失稳中起关键作用[97]。从机理上讲，我们发现cullin 3SPOP是一种生理泛素E3连接酶，可促进PD-L1的多泛素化和降解。我们进一步证明，cyclinD-CDK4以磷酸化的方式稳定SPOP，而CDK 4/6抑制剂Palboclib处理SPOP，使SPOP失稳，增加PD-L1蛋白丰度，可能诱导免疫逃逸[97]。病理上，SPOP中衍生功能缺失突变的癌症患者不能促进PD-L1多泛素介导的降解，从而导致PD-L1的稳定，同时肿瘤中TIL的数量减少[97]。值得注意的是，CDK 4/6激酶抑制剂Palbociclib与抗PD-1治疗协同提高了治疗效果，在同基因小鼠肿瘤模型中明显增强了肿瘤消退并提高了总体生存率[97]。
5.2、PD-L1单泛素化调控EGF刺激
除了多泛素化外，蛋白质还可以通过将一个泛素分子与一个(单泛素化)或多个赖氨酸(多泛素化)结合来进行单泛素化或多泛素化修饰，这些分子在调节各种细胞过程中起着关键作用，包括控制蛋白质的稳定性、定位、内吞和转运，而不依赖蛋白酶体介导的降解[98]。EGF可诱导PD-L1的单泛素化和多泛素化，从而稳定PD-L1[99]。此外，使用针对EGFR或泛素E1激活酶的化学抑制剂可显著降低PD-L1的单泛素化和多泛素化，同时降低PD-L1的总水平[99]。然而，特异性E3连接酶促进PD-L1单泛素化尚不清楚，需要进一步的深入研究来解决这一关键问题。有趣的是，Li等人发现EGF信号通路也可以正向调节PD-L1的稳定性，主要是通过使GSK3β失活和抑制GSK3β介导的PD-L1磷酸化，从而阻止E3连接酶适配器蛋白β-TRCP介导的PD-L1多泛素化和随后的降解[96]。因此，进一步探讨EGF诱导的单泛素化与GSK3β/β-TRCP介导的多泛素化之间是否存在交互作用，以及如何利用这些研究成果设计新的联合疗法治疗人类癌症是有必要的。
5.3、CSN5对PD-L1的去泛素化调控调控肿瘤免疫治疗
泛素化是一种可逆的过程，其中去泛素酶(DUBS)催化单一泛素或多泛素链从目标蛋白中除去[100]。越来越多的证据表明，DUBS的突变或表达失调导致各种人类疾病，包括免疫疾病和癌症[101，102]。因此，开发选择性DUBS抑制剂已被提出作为一种新的治疗策略，用于人类免疫疾病和癌症治疗。最近，COP9信号小体5(CSN 5)被鉴定为PD-L1去泛素化的底物，从而稳定了PD-L1对T细胞的抑制[103]。Lim等人进一步证实，肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激通过诱导转录因子NF-kB p65亚单位与CSN 5启动子结合，促进CSN 5的转录，从而增强CSN 5的表达[103]。在TNF-α诱导的CSN 5与PD-L1结合后，CSN 5去除PD-L1上的多泛素链，从而稳定PD-L1，从而促进肿瘤免疫逃逸[103]。与这些发现一致，天然化合物姜黄素对CSN 5的抑制降低了TNF-α/NF-kB信号诱导的PD-L1稳定性，后者与抗CTLA-4治疗协同增强抗肿瘤免疫和延缓肿瘤生长[103]。
5.4、GSK3β和AMPK磷酸化PD-L1，影响PD-L1蛋白的稳定性
在许多人类疾病中，包括神经退行性疾病、炎症性疾病和癌症在内的许多疾病中，都经常观察到激酶依赖的磷酸化信号事件的失调[104,105]。近年来，JAK、mTOR-Akt和LATS 1/2激酶依赖通路等关键激酶信号通路在调节肿瘤免疫治疗疗效中起着关键作用[58,106,107]。如上所述，已有报道GSK3β直接与PD-L1的C端结构域结合，并在PD-L1上磷酸化T180和S184，随后被β-TRCP确认，促进PD-L1的多泛素化和降解[96]。作者进一步证明，通过抑制GSK3β的上游负调控因子EGF信号而激活GSK3β可以显著降低PD-L1水平，增强PD-1对小鼠肿瘤模型的阻断作用[96]。
AMP激活的蛋白激酶(AMPK)是调节细胞代谢和能量稳态的能量传感器[108]。此外，新的证据也表明AMPK激活调节T细胞代谢和功能[109]。然而，AMPK信号通路如何调节癌症免疫治疗仍然是个谜。Cha等人最近发现，二甲双胍激活的AMPK直接在S195残基上磷酸化PD-L1，诱导异常的糖基化，从而导致PD-L1通过ERAD途径降解[110]。值得注意的是，这项研究还表明二甲双胍联合CTLA-4阻断可显著抑制同基因小鼠模型的肿瘤生长[110]。另外，PD-L1在EGF处理后也被磷酸化[99]。然而，EGF诱导PD-L1磷酸化的生理功能需要进一步深入研究。
5.4、靶向糖基化PD-L1根除三阴性乳腺癌(TNBC)
越来越多的证据表明，蛋白质糖基化在调节包括阿尔茨海默病、心血管疾病和癌症在内的各种人类疾病中发挥着重要作用[111]。N-连接蛋白和O-连接蛋白的糖基化反应，分别通过天冬酰胺的氮原子或丝氨酸、苏氨酸、羟基赖氨酸或羟脯氨酸残基的氧原子与甘氨酸共价结合，已经得到广泛的研究[112]。最近的研究表明糖基化失调可能成为一个新的癌症标志和潜在的治疗靶点，因为它已被证明与肿瘤的发生、血管生成、侵袭、转移和免疫监视有关[112,113]。Hung团队研究表明PD-L1可以被N-链糖基化修饰，这在很大程度上可以通过阻止GSK3β/β-TRCP介导的PD-L1泛素化和降解来稳定PD-L1[96]。他们还发现，上游EGF信号诱导PDL1N-连接糖基化，稳定PD-L1，从而导致肿瘤细胞免疫抑制[96]。因此，利用小分子吉非替尼抑制EGF信号可破坏PD-L1的稳定性，促进抗肿瘤免疫[96]。
此外，EGF信号转导上调了β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖苷转移酶(B3GNT3)的表达，促进了TNBC细胞中PD-L1上N192和N200位点的N糖基化，这是与细胞毒T细胞上PD-1结合并导致T细胞衰竭所必需的[114]。值得注意的是，Hung团队开发了一种针对糖基化PD-L1(gPD-L1)和gPD-L1抗体-药物结合物(g-PD-L1-ADCs)的特异性抗体，它可以阻断PD-L1与PD-1的相互作用，并促进PD-L1内化以促进溶酶体介导的降解[114]。此外，他们的结果表明，g-PD-L1-ADC可激活细胞毒性T细胞，并发挥旁观者效应，杀死不表达PD-L1的癌旁细胞，表明靶向PD-L1糖基化可能是一种潜在的提高肿瘤免疫治疗效果的策略[114]。此外，N-糖基转移酶STT3还可以稳定和上调肿瘤干细胞中PD-L1的活性，从而逃避肿瘤免疫监视，这将为抑制STT3酶活性破坏PD-L1的稳定提供另一个治疗靶点，以利于PD-1/PD-L1介导的检查点阻断[115]。
5.5、PD-L1结合组分对PD-L1蛋白稳定性的调节
除了上面提到的PTMs外，通过大规模的基因筛选，两个独立的团队确定CKLF样的MARVEL跨膜结构域包含蛋白6(CMTM6)是PD-L1的关键正调控因子[116,117]。两个团队均报告CMTM6的缺失显著降低了多个人类肿瘤细胞系中PD-L1的表达[116,117]。他们进一步发现CMTM6通过不同的机制将PD-L1稳定在翻译后水平。Burr等人表明，除了在质膜外，CMTM6还与PD-L1共存，这有助于内陷PD-L1的再循环，从而防止溶酶体介导的降解(图5)[117]。Mezzadra和他的同事证实CMTM6与PD-L1在细胞表面相互作用，抑制PD-L1的泛素化，这可能依赖于泛素E3连接酶STUB 1[116]。此外，他们还发现CMTM4，而不是其他CMTM家族成员，在CMTM 6缺乏细胞时起着补充作用[116]。此外，整合膜支架蛋白Sigma1在很大程度上通过阻止PD-L1[118]的自噬降解而稳定和提高肿瘤细胞中PD-L1，而伴侣FKBP51则稳定胶质瘤中PD-L1(图5)[119]。有趣的是，PD-L1的Sigma1和FKBP51都是通过内质网(ER)中PD-L1的糖基化来稳定的[118,119]。总之，这些研究表明，针对这些上游调控因子，包括CMTM 4/6、Sigma1和FKBP51，减少PD-L1的表达可能是增强PD-1/PD-L1免疫检查点阻遏的另一种策略，这有可能提供与其他免疫疗法(如抗CTLA 4治疗)相结合的优势。
6、DNA损伤通路调控PD-L1
6.1、基因组不稳定性决定免疫检查点封锁的敏感性
基因组不稳定性，由外源DNA损伤剂或内源性DNA修复缺陷所驱动，赋予癌细胞基因组改变的可能性增加，并被列为肿瘤最常见的特征之一[120]。在正常细胞中双链断裂(DSB)时，最初的DNA损伤反应(DDR)传感器-核酸激酶共济血管扩张突变(ATM)被激活[121]，随后将此信号转导到下游效应分子，如检查点激酶ATR、Chk1、Chk2和p53肿瘤抑制因子[122-128]，后者反过来阻止细胞周期进程，使DNA损伤修复开始，或在DNA损伤太大的情况下促进损伤诱导的细胞凋亡[129-132]。癌细胞能够通过表达抑制性蛋白来抑制T细胞功能而逃避免疫监视，例如定义良好的PD-L1免疫检查点分子[14,133]。值得注意的是，最近的研究表明，基因组不稳定性与检查点抑制剂免疫治疗反应之间的关系，主要是通过产生新抗原，这使DNA损伤与免疫系统之间的相互作用引起了人们的注意[134-136]。鉴于有几篇综述讨论了这一主题[137-141]，我们将具体讨论DNA损伤在PD-L1表达调控中的作用(图6)。
6.2、PD-L1表达的DNA损伤调控机制
如前所述，JAK-STAT-IRF1通路已被证明能够调节PD-L1的表达[45,142]。DNA损伤在调节JAK-STAT信号级联中也起着关键作用(图6)。例如，STAT1以依赖于p53的方式被激活[143]，而JAK1和STAT3在DNA损伤剂处理后表现出增强的磷酸化和转录活性[144]。这些结果表明DNA损伤与PD-L1表达之间存在潜在的联系。为了支持这一观点，最近的一项研究表明，DSB以JAK-STAT-IRF1依赖的方式调节PD-L1的表达[145]。有趣的是，STAT3也能够调节DDR通路[146-148]，在DDR和JAK-STAT信号完整性之间建立一个反馈回路。
DNA损伤事件引起的双链断裂(DSB)触发：(1)ATM/ATR激酶激活；(2)胞浆DNA生成，两者最终激活JNK-STAT信号级联并上调PD-L1表达；(3)修复不足或容易出错导致基因改变和新抗原形成，从而促进T细胞识别。cGAS，cGMP-AMP合酶；IRF，干扰素调节因子；JAK，c-jun氨基末端激酶；PD-L1，程序性死亡配体1；STAT，信号转导和转录激活因子。
此外，肿瘤细胞含有由DSBs产生的胞浆DNA[149]，这将进一步促进胞浆DNA传感器，如定义明确的cGMP-AMP合成酶(CGAS)和DNA依赖的蛋白激酶(DNA-PK)[150,151]。cGASSTING途径和DNA-PK对胞浆DNA的识别随后激活了干扰素调节因子3(IRF3)[152,153]，解释了DNA损伤和IRF3激活之间的因果关系[154]。因此，IRF3的激活促进I型干扰素的产生[155,156]，激活JAK-STAT通路，并提高PD-L1的表达(图4)[45,142]。最近的研究表明，S期DNA损伤诱导的PD-L1表达在很大程度上是依赖于STING[157]。
6.3、靶向DNA损伤修复，增强抗PD -1/PD-L1疗效
鉴于突变负担和新抗原形成高度相关的观察[158]，除了基因组不稳定背景下PD-L1表达水平的增加外，我们推测突变负担较高的肿瘤含有更多的新抗原，这有利于肿瘤浸润性T细胞识别。然而，PD-L1蛋白水平的升高使得PD-L1阻断剂对细胞毒性T细胞重新激活以靶向肿瘤细胞的作用更为关键。的确，多项临床研究已观察到PD-L1表达水平与新抗原负荷呈正相关[159,160]，突变负担较高的肿瘤更易受PD-1/PD-L1阻断剂[135]的影响。
基于这些研究，联合使用DNA损伤剂和PD-1/PD-L1检查点显示了令人鼓舞的结果。例如，电离辐射(IR)提高了肿瘤微环境中的PD-L1，抗PD-L1增强了小鼠的抗肿瘤免疫能力[161]；PARP抑制剂上调PD-L1的表达并与PARP抑制剂和抗PD-L1联合治疗显著提高体内疗效[162]；cGAMP和抗PD-L1联合使用的抗肿瘤作用比单独使用更强[163]。目前，DNA损伤检查点与PD-1/PD-L1免疫检查点相互作用的研究尚处于起步阶段，需要进一步研究它们之间的关系，为DNA损伤剂联合免疫治疗癌症的临床试验提供理论依据。
7、结束语和未来展望
免疫疗法的成功，特别是针对PD-1/PD-L1通路的成功，为更好地治疗和可能治愈癌症带来了希望和信心[4,5]。下一步，我们应该探索如何提高PD-1/PD-L1阻滞的疗效和有效率，以使更多的癌症患者受益。为此，深入研究和阐明PD-1/PD-L1通路调控的分子机制，将是设计新的抗PD-1/PD-L1耐药、提高肿瘤治疗免疫功能的治疗策略的关键步骤之一。
根据抗PD-1/PD-L1免疫治疗的临床试验结果，PD-L1表达水平是否是PD-1/PD-L1阻断治疗效果的预测生物标志物，在个体患者水平上仍存在争议。虽然越来越多的证据表明PD-L1阳性(PD-L1+)肿瘤患者比PD-L1-阴性(PD-L1)患者在不同癌症类型中有更好的应答率和总体生存率，但也有报道PD-L1+肿瘤患者对抗PD-1/PD-L1治疗有抵抗，也有少量PD-L1肿瘤患者受益于这些治疗[164-167]。正如我们前面所讨论的，各种细胞信号通路可以在基因组、转录后、翻译和翻译后水平调控PD-L1的表达，从而影响抗PD-1/PD-L1治疗。然而，目前尚缺乏标准的方法来评估PD-L1在肿瘤细胞上的表达量，以允许对PD-1/PD-L1的阻断作出反应。此外，肿瘤细胞PD-L1的表达与PD-1/PD-L1的阻断反应有关，PD-L1的表达是由浸润性T细胞分泌的IFNγ诱导产生的适应性免疫抵抗，这在最近的文献[168-170]中得到了很好的讨论。此外，PD-L1在肿瘤微环境中肿瘤浸润免疫细胞上的表达，特别是巨噬细胞、树突状细胞和基质细胞，也是PD-1/PD-L1阻断[164,166,171,172]的关键。然而，在目前的大多数临床试验中，当肿瘤活检评估PD-L1的表达时，PD-L1在肿瘤细胞或浸润免疫细胞等细胞类型上的表达没有差别。此外，还需要评估其他重要的信号通路或修饰，包括泛素样修饰、甲基化或乙酰化，是否能够调节PD-L1表达水平以控制抗肿瘤免疫(见突出问题)。
由于PD-1是靶向PD-1/PD-L1免疫检查点阻断的重要环节，因此调控PD-1在T细胞上的表达也可能是增强抗PD-1/PD-L1免疫治疗的关键。因此，探索PD-1 PTMs的上游信号通路，如泛素化、糖基化、乙酰化和甲基化等，将有助于理解和设计更好的策略，提高PD-1/PD-L1阻断剂的应答率和疗效。此外，额外的免疫调节靶点，如淋巴细胞激活基因-3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白-粘蛋白结构域3(TIM3)、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)以及肿瘤微环境中的吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)或转化生长因子-β(TGF-β)都显示出抑制抗肿瘤免疫的能力[11]。我们需要进一步的研究来探索这些在肿瘤微环境中的靶点是如何在不同程度上被调节的，以及操纵这些靶点的表达是否会影响抗肿瘤免疫反应。
亮点
PD-1/PD-L1免疫检查点阻断在人类肿瘤治疗中显示出良好的疗效。然而，只有有限的癌症患者(15%-25%)对抗PD-1/PD-L1免疫治疗有反应。因此，探索耐药机制将提高患者的选择、应答率和抗PD-1/PD-L1治疗的有效性，从而使更多的癌症患者受益。
最近的研究表明，PD-L1在肿瘤细胞上的表达水平可能与PD-1/PD-L1阻断剂的反应率和疗效有关。因此，了解PD-L1分子调控机制将为进一步改善PD-1/PD-L1在肿瘤治疗中的阻断作用提供更多的策略。
越来越多的证据表明PD-L1是通过多种机制调控的，包括基因组改变、表观遗传修饰、转录调控、microRNAs、翻译后修饰和DNA损伤信号，以及PD-L1相互作用蛋白调节癌症患者的免疫抑制。
未决问题
除了已报道的泛素化、糖链化和磷酸化外，还有其他翻译后修饰，如泛素样修饰、甲基化、乙酰化等。琥珀酸钠调节PD-L1表达以控制肿瘤患者的免疫抑制？
非编码RNA(ncRNAs)，包括microRNAs(MiRNAs)、长非编码RNA(lncRNAs)和环状RNA(CircRNAs)在调控基因表达以控制肿瘤发生和肿瘤免疫方面起着重要作用。然而，除了miRNAs对PD-L1表达的调控外，在免疫监视方面，目前还不清楚lncRNAs和circRNAs是否也参与调控PD-L1的表达，从而控制肿瘤免疫治疗。
虽然PD-1的表达在转录水平上得到了很好的研究，但有关PD-1翻译后修饰的上游信号通路的研究较少。因此，探索PD-1翻译后修饰的上游信号通路，如泛素化、糖基化、乙酰化和甲基化等，将有助于理解和设计更好的策略来提高PD-1/PD-L1阻断的应答率和疗效。
除PD-L1/PD-1外，LAG 3、TIM3、TIGIT、IDO、TGF等免疫调节靶点均表现出单独作用或与抗PD-1/PD-L1协同作用。然而，这需要深入研究，以探讨如何在细胞中调节这些靶点，以及是否操纵它们。表达水平可以控制抗肿瘤免疫反应。
文章原文：Biochemical Aspects of PD-L1 Regulation in Cancer Immunotherapy.
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