三阴性乳腺癌的肿瘤特异性CD8阳性T细胞免疫治疗

王梦川，吴爱国

南方医科大学珠江医院

　　三阴性乳腺癌（TNBC）是雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体2（HER2）表达均为阴性的一类乳腺癌，临床上常规的治疗手段包括手术、放射治疗及化疗。肿瘤的免疫治疗是目前的研究热点之一，其中起重要作用的是肿瘤特异性分化群8（CD8）阳性T细胞。在基础研究方面，CD8阳性T细胞在TNBC的过继性免疫治疗和肿瘤疫苗领域均有所应用。在临床研究方面，肿瘤浸润CD8阳性T细胞与TNBC患者的预后相关，并且，目前已开展的程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）/程序性细胞死亡蛋白1配体（PD-L1）抑制剂亦与肿瘤特异性CD8阳性T细胞的活化调控机制有关。因此，笔者就肿瘤特异性CD8阳性T细胞在三阴性乳腺癌免疫治疗中的应用进行简要的综述。

通信作者：吴爱国，[e-mail]

原文参见：中华乳腺病杂志. 2017;11(5):292-295.

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　　根据ER、PR及HER2的表达情况，可将乳腺癌分为5种亚型，分别是管腔A型、管腔B型、管腔B型HER2阳性、HER2过表达型和三阴型（TNBC）【1】。其中，TNBC患者占乳腺癌全部患者比例的10%～17%，其临床特点是癌细胞ER、PR和HER2表达均为阴性，患者发病年龄偏低，疾病进展快且较早出现内脏转移【2】。目前，对于可手术切除的TNBC，手术联合放化疗是常规治疗手段，而对于转移性TNBC尚无有效的治疗手段，多学科综合治疗可能是延长患者生存期的方法之一【3】。

　　根据最新的转录组学研究分类可将TNBC分为6种亚型，分别是基底1型、基底2型、免疫调节型、间质型、间质干细胞型和管腔雄激素受体型【4】。在上述各亚型中，免疫调节型的患者具有相对好的预后，可能与体内癌细胞的免疫应答基因被激活有关【5】。目前，针对TNBC的免疫治疗是学者们关注的热点之一，肿瘤特异性T细胞又是研究的重中之重，且部分临床试验已取得了令人瞩目的效果。依据不同的功能分类，肿瘤特异性T细胞又可进一步分为CD8细胞毒性T细胞、CD4辅助T细胞和CD4调节T细胞【5-6】。笔者将近年来肿瘤特异性CD8阳性T细胞在TNBC研究中的应用作一简要的综述。

　　一、肿瘤特异性CD8阳性T细胞的免疫效应概述

　　在TNBC细胞的生物学行为中，免疫系统扮演了双重角色——促进肿瘤生长和清除肿瘤。这看似矛盾的两方面实际上包含了不同细胞之间的相互作用，这些细胞包括肿瘤细胞、免疫细胞和肿瘤间质细胞等【7】。

　　在体内环境下，肿瘤细胞与免疫细胞之间的关系通常经历3个时期：清除期、平衡期和逃逸期。在清除期，先天性免疫首先发挥作用，由巨噬细胞和自然杀伤细胞引起急性炎症反应，随后获得性免疫进一步起效，包括树突状细胞捕获肿瘤抗原并将其递呈给初始CD8阳性T细胞，后者再转化为肿瘤特异性CD8阳性T细胞并进入肿瘤微环境中靶向杀伤肿瘤细胞，此阶段肿瘤细胞主要被免疫细胞所“清除”。在平衡期，未被清除的肿瘤细胞发生突变，例如不表达主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类分子、共刺激信号分子和隐藏肿瘤抗原，从而不被之前活化的CD8阳性T细胞识别，并且，肿瘤细胞还可招募调节T细胞以抑制肿瘤特异性CD8阳性T细胞的靶向杀伤作用，经历上述过程后炎症反应从急性期进入慢性期，肿瘤细胞与免疫细胞亦处于相对“平衡”的阶段。在逃逸期，肿瘤细胞通过自身突变以及间质细胞的帮助，从肿瘤特异性CD8阳性T细胞的作用范围内“逃逸”，从而导致肿瘤的局部扩散和远处转移【5】。

　　正因为肿瘤细胞具有非常强的免疫逃逸能力，体内环境下由初始CD8阳性T细胞转化而来的肿瘤特异性CD8阳性T细胞并不能完全杀灭肿瘤细胞。因此，学者们希望通过各种方式获得靶向杀伤能力更强的CD8阳性T细胞。

　　二、CD8阳性T细胞与TNBC过继性免疫治疗研究

　　过继性免疫治疗的原理是采集人体的免疫细胞，经体外改造和扩增后再输注回人体发挥抗肿瘤作用【6】。过继性免疫治疗的效应细胞包括CD8阳性T细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞等，目前常用的效应细胞是CD8阳性T细胞【8】。体外获得肿瘤特异性CD8阳性T细胞的方法主要有2类：一类是与肿瘤抗原接触后筛选出具有靶向识别能力的CD8阳性T细胞；另一类是采用各种方法直接改变CD8阳性T细胞受体（TCR）的表达序列，使其靶向识别肿瘤抗原，即嵌合抗原受体（CAR）T细胞【8】。

　　依据第一类方法，Harao等【8】使用一种针对4-1BB/CD137蛋白的抗体乌瑞鲁单抗，可刺激TNBC瘤体内4-1BB/CD137高表达的CD8阳性T细胞活化，从而靶向杀伤已发生基因突变的TNBC细胞，而对正常组织细胞无杀伤作用。Chandra等【9】发现冷冻消融加上姜黄素可激活识别肿瘤抗原的CD8阳性T细胞，这些CD8阳性T细胞可显著抑制BALB/c小鼠体内4T1细胞（一种来源于BALB/c小鼠自发性乳腺肿瘤的TNBC细胞系）的生长。另外，与肿瘤抗原接触后筛选肿瘤特异性CD8阳性T细胞的方法在黑色素瘤的临床治疗方面已取得了成果，而在实体瘤（包括TNBC）的研究尚未广泛开展，其中一个主要原因是筛选出的CD8阳性T细胞进入体循环后，并不能直接靶向定居于实体瘤内，从而大大降低CD8阳性T细胞的抗肿瘤效应。因此，学者们正在开展相关研究试图克服这一问题，其中一个突破口是将黑色素瘤治疗成功经验应用到TNBC【10】。例如，携带有针对黑色素瘤MAGE-C2（MC2）表位的TCR序列CD8阳性T细胞能有效杀伤黑色素瘤细胞，Kunert等【10】将这一效应延用至TNBC免疫治疗研究：他们先用氮胞苷和丙戊酸预处理TNBC细胞，使其MC2表位表达上调，再将CD8阳性T细胞作用于TNBC细胞，结果发现其中一种CD8阳性T细胞的TCR序列能特异性靶向识别TNBC细胞的MC2表位，从而能有效杀伤癌细胞但不损伤正常的组织细胞。

　　如前所述，除了筛选靶向识别肿瘤抗原的CD8阳性T细胞，过继性免疫治疗的另一应用是针对不同肿瘤抗原建立CAR-T细胞，从而达到靶向杀伤癌细胞的目的。例如，叶酸α受体（FRα）和间皮素均可作为TNBC的理想标志物，Song等【11】针对FRα构建出CAR-T细胞，可在体外环境下特异性杀伤FRα阳性TNBC细胞，同时亦能显著抑制小鼠体内FRα阳性TNBCMDA-MB-231细胞的成瘤速度。Tchou等【12】设计出针对间皮素的CAR-T细胞，经检测发现，体外条件下CAR-T细胞靶向杀伤TNBC细胞的有效率为31.7%，而初始CD8阳性T细胞的有效率仅为8.7%。当然，并非所有的肿瘤抗原均可用于设计CAR-T细胞，而需满足如下3个条件：1、该抗原属于细胞膜蛋白；2、该抗原在肿瘤细胞中高度表达；3、该抗原在正常组织细胞不表达或表达极低。通常前两个条件容易满足，但不一定符合第3个条件，如此设计出的CAR-T细胞将有可能杀伤表达该抗原的正常组织细胞，从而造成不同程度的不良反应【13】。

　　三、肿瘤疫苗对CD8阳性T细胞的调控作用

　　肿瘤疫苗的作用机制是利用疫苗刺激抗原递呈细胞（APC），后者会将肿瘤抗原递呈给效应细胞（CD8阳性T细胞、T辅助细胞等），其中CD8阳性T细胞可直接发挥抗肿瘤效应。Zhang等【14】从患者的外周血单核细胞中提取APC，再将APC与MDA-MB-231细胞进行电熔以制备疫苗，该融合疫苗在体外条件下可诱导肿瘤特异性CD8阳性T细胞，靶向杀伤MDA-MB-231细胞。与此类似，Paret等【15】根据53%的TNBC患者癌细胞表达CXorf61蛋白这一特点，构建CXorf61的RNA编码逆转录病毒并转染树突状细胞，再将其与人CD8阳性T细胞共培养可获得特异性识别CXorf61的66-74表位CD8阳性T细胞；并且，他们继续用CXorf61的RNA编码逆转录病毒接种于人白细胞抗原（HLA）-A*02转基因小鼠，在小鼠体内亦获得CXorf61特异性T细胞，并进一步克隆出针对CXorf61蛋白的HLA-A*0201限制性识别表位（66-74和79-87）。

　　事实上，除了上述研究以外，还可通过向实验动物接种疫苗从而在体内条件下获得肿瘤特异性CD8阳性T细胞。例如，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体2（TRAIL-R2）在实体瘤细胞广泛表达，通过携带TRAIL-R2的DNA质粒构建疫苗并输注入BALB/c小鼠体内，可获得TRAIL-R2特异性T细胞，进而靶向杀伤TRAIL-R2高表达的TNBC细胞【16】。在C57BL/6小鼠负瘤模型中，采用共刺激因子CD137激动剂和免疫检查点抗体联合放射治疗可诱导肿瘤特异性CD8阳性T细胞的活化，这些CD8阳性T细胞的共同特点是在佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）和离子霉素的刺激下，可表达Tim-3、颗粒酶B和Ki67，并分泌γ干扰素以增强抗肿瘤效应【17】。

　　四、肿瘤浸润CD8阳性T细胞与TNBC患者的预后

　　肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）是指浸润于肿瘤组织中的淋巴细胞。已有研究证实，TIL与TNBC患者的预后具有相关性【18】。目前临床研究的趋势是将TIL进一步分为不同亚组，以观察这些亚组的细胞数量或比例与患者预后的关系。这些亚组包括CD8阳性T细胞、CD4辅助T细胞和CD4调节T细胞等，且超过60%的TNBC淋巴细胞浸润是以CD8阳性T细胞为主【19】。一篇荟萃分析发现TIL与TNBC患者的无病生存和总生存具有正相关性，而进一步分析可知，CD8阳性T细胞的数量与患者无病生存也具有正相关性【20】。

　　对于不同分期的TNBC患者，肿瘤浸润CD8阳性T细胞具有相似的预后作用（表1）【21-26】。Miyashita等【21】观察了131例接受新辅助化疗的TNBC患者，发现肿瘤浸润CD8阳性T细胞数量较高预示着患者有更长的无复发生存期和乳腺癌特异性生存期，并且CD8阳性T细胞/调节T细胞数比例亦能预示患者的无复发生存期。Asano等【22】观察了该院2007—2013年177例早期可切除的乳腺癌患者标本，结果发现TNBC患者的肿瘤浸润CD8阳性T细胞/调节T细胞比例较其他类型的乳腺癌患者高，且这类患者在接受新辅助化疗后更易获得病理上的完全缓解。同样，Mella等【23】观察了197例患者的肿瘤标本，发现肿瘤浸润CD8阳性T细胞数量升高预示着TNBC患者有更长的疾病特异性生存期；而对于淋巴结阴性的TNBC患者，CD8阳性T细胞数量与患者的总生存和无病生存具有正相关性【24】。

表1　近年关于肿瘤浸润CD8阳性T细胞与三阴性乳腺癌患者预后的临床研究

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• Miyashita【21】2015年日本接受新辅助化疗的三阴性乳腺癌患者131例，免疫学指标：肿瘤浸润CD8阳性T细胞数量、CD8阳性T/调节T细胞比例，疗效指标：RFS、BCSS

• Asano【22】2016年日本接受新辅助化疗的早期乳腺癌患者177例，免疫学指标：肿瘤浸润CD8阳性T/调节T细胞比例，疗效指标：pCR

• Mella【23】2015年芬兰接受初始治疗的乳腺癌患者197例（包括95例三阴性乳腺癌患者），免疫学指标：肿瘤浸润CD8阳性T细胞数量，疗效指标：肿瘤增殖指数、DSS

• Chen【24】2014年中国淋巴结阴性的乳腺癌患者332例（包括50例三阴性乳腺癌患者），免疫学指标：肿瘤浸润CD8阳性T细胞数量，疗效指标：DFS、OS

• Ali【26】2014年英国乳腺癌患者12439例，免疫学指标：肿瘤浸润CD8阳性T细胞数量，疗效指标：BCSM

• Liu【25】2012年加拿大早期浸润性基底细胞癌患者3392例，免疫学指标：瘤体内CD8阳性T细胞浸润、肿瘤间质CD8阳性T细胞浸润，疗效指标：BCSS

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注：RFS（无复发生存）；BCSS（乳腺癌相关生存）；DSS（疾病相关生存）；BCSM（乳腺癌相关死亡率）

　　根据CD8阳性T细胞在肿瘤组织中的浸润范围，将肿瘤浸润CD8阳性T细胞进一步分为2类，包括肿瘤浸润CD8阳性T细胞和肿瘤间质浸润CD8阳性T细胞，而前者可以更加准确地预测患者的预后。Liu等【25】比较了瘤体内和肿瘤间质内CD8阳性T细胞的浸润情况，发现前者与患者较好的疾病特异性生存期相关，而后者则无明显相关性。另一项研究亦证实，瘤体内CD8阳性T细胞浸润预示着TNBC患者疾病特异性病死率下降28%，而肿瘤间质内CD8阳性T细胞浸润预示患者的疾病特异性病死率仅下降21%【26】。

　　五、CD8阳性T细胞与免疫检查点抑制剂的临床试验研究

　　程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）及程序性细胞死亡蛋白1配体（PD-L1），存在于APC和CD8阳性T细胞表面，两者结合后可抑制CD8阳性T细胞的增殖，从而抑制CD8阳性T细胞介导的免疫应答。目前，PD-1/PD-L1抑制剂是肿瘤免疫治疗的研究热点之一。有研究证实，TNBC细胞同样表达PD-L1，且其表达水平与肿瘤浸润CD8阳性T细胞的数量具有一致性，因此，针对这类TNBC患者PD-L1抑制剂的治疗效果更好【27】。另一项研究表明，采用PD-1抑制剂潘布罗利珠单抗（pembrolizumab）治疗转移性TNBC可使该类患者的6个月无进展生存率达23.3%，而接受PD-L1抑制剂阿特珠单抗（MPDL3280A）治疗的TNBC患者，其6个月无进展生存率可达27%【28】。未来将会有更多的免疫检查点抑制剂用于临床试验，包括作用于PD-1/PD-L1和T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）受体等，其临床治疗效果也值得期待【28-29】。

　　六、结语

　　免疫治疗是目前TNBC治疗的研究热点，而肿瘤特异性CD8阳性T细胞在肿瘤疫苗、CAR-T细胞制备和免疫检查点抑制剂的应用方面均发挥着重要作用。当然，CD8阳性T细胞靶向治疗并非完美，仍然有很多问题亟待解决，例如，针对肿瘤抗原的CD8阳性T细胞也可能攻击携带有该抗原的正常组织细胞，从而造成不同程度的不良反应。如何筛选更具有特异性的肿瘤抗原是学者们面临的一个问题。其次，部分肿瘤抗原并非持续表达，而是会随着肿瘤细胞的突变而变化，一旦这些抗原发生变化，原先可以靶向识别该抗原的CD8阳性T细胞可能不再识别肿瘤细胞，从而造成癌细胞的逃逸。最后，瘤体内肿瘤浸润CD8阳性T细胞的存在预示患者有较好的预后，这些CD8阳性T细胞的抗肿瘤作用机制亦需要进一步研究。虽然目前还面临着许多的未知因素，但是在不久的将来，基于肿瘤特异性CD8阳性T细胞的免疫研究可能为TNBC患者的临床治疗提供新的途径和选择。

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