截止至2021年4月，国内19项干细胞药物临床试验申请（IND）获国家药品评审中心（CDE）受理，其中14项获得默许进入临床试验资格。干细胞产业化所面临着巨大的挑战，其中关键的瓶颈问题是干细胞的高质量和规模化生产。无论是以多层“细胞工厂”为代表的平皿制造工艺，还是生物反应器制造工艺，均有各自的局限性。规模化细胞制造工艺，不能只是简单考虑细胞扩增数量，更应该关注扩增后干细胞质量能否保持均一性。本文将针对对“干细胞3D微载体规模化生产工艺”，进行探讨。1
不同规模化制备工艺和微载体的选择
平皿制备工艺可满足于中小规模的细胞生产需求，但存在人工成本高、生产空间需求大、细胞产品批次生产数量有限、批次间质量不稳定等问题，严重制约着干细胞产业化的发展。
生物反应器制备工艺，可作为细胞体外培养的平皿制备工艺替代品。主要有两类：以中空纤维生物反应器为代表的灌注式生物反应器和基于微载体的悬浮搅拌式生物反应器。
中空纤维生物反应器可用于贴壁细胞、悬浮细胞、细胞分泌物（外泌体等）的生产制备，一次运行可生产4-6×10*8 数量的间充质干细胞（MSCs）；但在贴壁细胞培养过程中，无法实时监测细胞增殖状态和质量情况，且收获过程面临着胰酶消化时间长，细胞的收获效率及质量都难以保障。
在搅拌悬浮式生物反应器中，干细胞通常附着在悬浮于搅拌容器中的微载体上。作为干细胞粘附培养介质，选择合适的微载体是干细胞培养扩增过程中保证细胞数量和质量的关键变量。微载体不仅要满足不同类型干细胞的粘附和增殖要求，还要考虑如何去除微载体，保证细胞治疗产品的安全性情况下进行细胞收获操作，且收获的细胞满足干细胞的基本生物学质量要求。目前市场上销售的商业化微载体，绝大多数是以收获细胞表达产物为目标，不能满足细胞治疗企业以收获质量稳定、符合临床应用需求的细胞的目的。华龛生物的3D明胶微载片（3DTableTrix®) 是一款多孔微载体，其核心成分为动物源蛋白与交联剂固固化成外形为100-200µm 的多孔微球。微载体原材料选用药用辅料级别并完成了第三方质量检测及安全性评价，3D TableTrix®微载片获得了国家药品审评中心（CDE）药用辅料资质备案（F20210000003与F20210000496），同时也完成了美国FDA/DMF药用辅料资质备案（DMF：35481）。定制化3DTableTrix® 微载体的基本特性
选择了合适的生物反应器和微载体，细胞制备企业还应根据自身情况（细胞类型、细胞库、细胞质量控制节点、细胞终产品剂型以及临床适应症等因素），建立适合企业自身的干细胞大规模生产制备工艺。下面，我们以脐带间充质干细胞（UC-MSCs）为代表，采用华龛3D TableTrix®微载片，结合华龛3DFloTrix®系列生物反应器，就基于3D微载体的大规模干细胞制备工艺所需考虑的因素进行探讨。MSCs产品的生产工艺是从供者体内获取组织，经组织分离、克隆培养而形成均一的细胞群体，经质量鉴定符合间充质干细胞基本生物学特性的条件下建立原始细胞库/种子库（Primary Cell Bank，PCB)。我们建议原始细胞库阶段仍采用传统的二维培养工艺，采用经全面质检合格的P2/P3代MSCs作为3D细胞培养工艺的种子细胞，接种到微载体上进行三维扩增培养。在接种起始细胞密度较低的情况下，可以选择较小规模的生物反应器（如：125ml/500ml 3D FloTrix ® miniSPIN 灌流式生物反应器)，随着细胞扩增数量的增加，进而逐级放大到中试规模（5L 3D FloTrix ®vivaSPIN 自动化生物反应器）及生产规模（10L/15L 3D FloTrix ® vivaSPIN-VS自动化生物反应器) 进行干细胞制备。- 微载体接种前是否需要经过称量、灭菌、溶胀等操作过程，经过这些操作过程的微载体如何进行质量控制；
- 细胞接种粘附到微载体上是静态接种，还是微载体悬浮搅拌过程中动态接种，如何保证细胞在微载体上的接种效率。
- 不同规模生物反应器的的起始参数设定（转速、溶氧、pH、通气量等）；
- 种子细胞制备所采用的培养基在三维扩增工艺中是否适用等。
MSCs在不同规格的生物反应器中进行连续动态扩增培养时，应考虑随着细胞培养规模逐级放大，如何保证细胞的稳定生长。应根据细胞常规指标（细胞密度、生长速率、活率、细胞倍增时间等），设备的关键控制参数（温度、DO、pH、搅拌速度和通气流量等）来设定个体化的干细胞扩增工艺参数，包括：细胞在不同规模体系中的起始接种密度及培养的时间；
细胞如何从微载体上收获并转移到新的体系中；
细胞是连续逐级扩增放大最终形成工作细胞库，还是在某个三维扩增体系节点建立主细胞库，进而再放大到工作细胞库；
培养基换液时间节点、如何在不损失细胞的情况下进行换液；
如何界定细胞代次；
在干细胞大规模扩增时如何监测细胞的增殖状况和质量，经三维扩增培养的细胞质量检验项目及标准如何设定。
根据不同组织来源的MSCs生长特性，华龛生物可定制化设计干细胞三维扩增培养工艺参数，不仅满足扩细胞数量的需求，更能满足细胞的质量（基本生物学属性、微生物学安全性、生物学安全性及生物学有效性等）；细胞质量达到《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）2015》中关于干细胞制剂的质量控制标准，所有三维扩增工艺参数均经过反复验证以保证不同类型干细胞制备工艺的稳定性。微载体能够显著提高细胞扩增数量，但并不建议为了追求细胞数量而在微载体上长时间培养。原因在于干细胞在培养过程中不断分泌各种黏附因子，微载体容易聚团。在细胞收获过程中，如果采用胰酶长时间消化细胞，将损伤干细胞的表面标记物，影响细胞活力，最终影响干细胞质量。因此，如何将细胞从微载体上解离下来，又能保证细胞治疗产品的高质量，是干细胞大规模扩增工艺所必需考虑的问题。华龛生物针对3D TableTrix®微载片开发的微载体裂解液（3DFloTrix®Digest微载体裂解液），特异降解微载体材料，可实现全部干细胞的高效、温和收获，避免了传统胰酶消化液对干细胞的损伤。通过常规简单的清洗工艺，去除有害物质残留，符合干细胞制剂终产品的质量标准与安全性要求。干细胞经过生物反应器的扩增培养，可一次性制备多达10*10-10*12个细胞。如何在短时间内同时收获大量细胞，这对于传统的人工收获和冻存工艺是一个严峻的挑战。华龛生物正在开发与其生物反应器配套的干细胞自动化收获设备以解决这一问题。此外，经微载体连续扩增后的3D干细胞微组织（干细胞+微载体）亦可实现原位冷冻保存，便于储存、运输和临床应用。微组织冻存与复苏后仍保持干细胞活性、功能及3D结构。复苏后的微组织既可以作为下一批干细胞制备工艺的“种子”继续连续扩增，同时也可以作为新型的3D干细胞微组织创新药物进行原位注射再生治疗。3D干细胞微组织原位冻存后细胞特性
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文末小结
生物反应器制备工艺，不仅能满足细胞疗法在临床应用中对细胞数量和重量的需求，同时能够显著降低制备过程中耗材、人力、时间成本，也能保证细胞终产品的质量均一性，降低批次间差异。但无论采用何种生物反应器和微载体进行干细胞大规模制备，不能片面追求细胞数量，均应以细胞的关键质量属性及工艺的稳定性作为评价标准。在下篇，我们将就基于3D微载体大规模扩增工艺的干细胞质量控制及其产品的安全性进行详细讨论。
