缺血性疾病在全球范围内的发病率和死亡率较高，通过治疗性血管新生可以改善这些缺血区域的血流灌注，挽救濒死组织。然而，许多临床试验表明，针对缺血性疾病尤其是缺血性心脏病的促血管新生治疗收效甚微，很大程度是由于对血管新生分子基础仍不清楚，缺乏有效干预靶点。内皮间质化（Endothelial to mesenchymal transition, EndMT）是指内皮细胞在TGF-β、氧化应激等刺激因素下失去内皮表征并向间充质细胞转化的过程，EndMT在心血管系统的发育中起到重要作用，也参与瓣膜病、肺动脉高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展。
2024年1月，复旦大学附属中山医院、心脏病全国重点实验室葛均波院士、李华研究员团队在The Innovation（IF 32.1）在线发表题为“GTF2H4 regulates partial EndMT via NF-κB activation through NCOA3 phosphorylation in ischemic diseases”的研究成果，该研究利用4D Label free蛋白质组学+ 4D Label free磷酸化蛋白质组学技术，发现转录因子GTF2H4能够促进内皮细胞在缺氧微环境中发生部分内皮间质化，进而改善缺血后微循环灌注，为缺血性疾病的治疗改善提供了全新的思路。中科新生命为该研究提供了蛋白质组学+磷酸化蛋白质组学检测服务。
研究材料
过表达和敲低GTF2H4的人微血管内皮细胞（HEMC-1）及正常HEMC-1细胞
技术路线
步骤1：缺血缺氧环境诱导内皮细胞发生部分EndMT；
步骤2：转录组学发现GTF2H4能够正向调控缺氧诱导的部分EndMT；
步骤3：蛋白质组学筛选得到了GTF2H4的靶分子ERCC3；
步骤4：磷酸化蛋白质组学发现GTF2H4通过NCOA3磷酸化激活NF-κB-Snail促进部分EndMT；
步骤5：GTF2H4促进小鼠下肢缺血后的部分EndMT以及血流恢复。
研究结果
1. 缺血缺氧环境诱导内皮细胞发生部分EndMT
研究者首先通过体内实验发现小鼠心肌梗死后梗死边缘区内皮细胞逐渐获得α-SMA间充质标记物，通过体外实验发现微血管内皮细胞经缺氧处理后也获得α-SMA、Fibronectin等间充质标记物，并伴随有CD31和VE-Cadherin内皮标记物的部分丢失，内皮细胞的成管功能仍得以完全保留，结果提示缺血缺氧诱导内皮细胞发生部分EndMT。
图1 缺血缺氧环境诱导内皮细胞发生部分内皮间质化
2. GTF2H4缓解缺氧诱导的微血管内皮细胞损伤，并促进缺氧诱导的部分EndMT
基于前期获取的心肌梗死患者支架再通前后血液样本转录组测序结合GTEx数据库的相关研究结果，发现转录因子GTF2H4对缺氧信号显著响应，随后确证了时序性缺氧与内皮细胞中GTF2H4表达水平的关联，并通过基因编辑技术证实GTF2H4能够缓解缺氧诱导的微血管内皮细胞损伤，正向调控缺氧诱导的部分EndMT。
图2 GTF2H4促进缺氧诱导的部分EndMT
3. GTF2H4通过自噬介导的降解路径调控ERCC3，二者协同调控部分EndMT
为解析GTF2H4调控部分内皮间质化的分子机制，研究者利用4D Label Free蛋白质组学分析了过表达和敲低GTF2H4的人微血管内皮细胞（HEMC-1）及正常HEMC-1细胞的蛋白表达情况，筛选得到了GTF2H4的下游靶分子ERCC3，进而通过Co-IP实验验证了GTF2H4与ERCC3之间的互作关系，并发现GTF2H4通过自噬介导的降解路径调控ERCC3。深入研究发现GTF2H4调控缺氧诱导的部分EndMT依赖于其与ERCC3的结合，二者以复合体的形式协同发挥作用。
图3 GTF2H4通过自噬介导的降解路径调控ERCC3
4. GTF2H4通过NCOA3 S1330位点的磷酸化调控NF-κB激活的部分EndMT
为了阐明GTF2H4-ERCC3调控部分EndMT的下游通路，研究者利用4D Label Free磷酸化蛋白质组学分析了过表达和敲低GTF2H4的人微血管内皮细胞（HEMC-1）及正常HEMC-1细胞的磷酸化蛋白表达情况并开展通路富集，进一步通过双荧光素酶、EMA等实验证实GTF2H4主要通过NF-κB/Snail这一信号通路调控部分EndMT。进一步研究证实GTF2H4促进NCOA3上1330位点的丝氨酸发生磷酸化，进而结合p65以激活NF-κB-Snail通路，最终促进部分EndMT的发生。
图4 GTF2H4通过NCOA3磷酸化激活NF-κB促进部分EndMT
5. GTF2H4促进小鼠下肢缺血后的部分EndMT以及血流恢复
最后，研究者在动物体内实验，利用内皮靶向AAV感染小鼠腓肠肌实现小鼠下肢内皮细胞GTF2H4高表达或敲低的基因编辑干预后，构建小鼠下肢缺血模型并动态监测小鼠下肢血流恢复情况，发现GTF2H4能够显著改善下肢缺血后血运重建，并伴随有部分EndMT的发生。
图5 GTF2H4促进小鼠下肢缺血后的部分EndMT以及血流恢复
小结
该研究在发现转录因子GTF2H4能够促进内皮细胞在缺氧微环境中发生部分内皮间质化，改善缺血后微循环灌注后，利用蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学策略详尽阐明了其潜在的分子机制，发现转录因子GTF2H4能够通过NCOA3/NF-κb/Snail通路促进缺血缺氧诱导的部分内皮间质化，改善缺血后血运重建和组织修复。研究结果提示GTF2H4可能在缺血性疾病的靶向干预治疗中具有一定医学转化意义。
图6 内皮间质化在缺血性疾病血管新生中的关键作用及机制
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