【癌症】生物钟的破坏可重塑肿瘤免疫微环境

2020年10月，来自弗吉尼亚理工大学弗林生命科学研究所的Finkielstein课题组与阿根廷国立基尔梅斯大学的Golombek课题组在Science Advance上发表了题为“Circadian disruption promotes tumor-immune microenvironment remodeling favoring tumor cell proliferation” 的文章，该研究以黑色素瘤小鼠为模型阐述了慢性昼夜节律紊乱对肿瘤免疫微环境重塑和肿瘤生长的影响^[1]。

——背景——

昼夜节律也就是生物钟是自然界中的有机体在长期进化过程中形成的一种近似24小时的节律性规律。在哺乳动物中，生物钟由正向转录因子Clock和Bmal1，负调控因子Per和Cry组成的转录翻译负反馈环路所调控，以此维持机体生理行为的节律性（例如，睡眠、发育、免疫和代谢等）。全基因组转录谱分析表明，约10%的细胞转录组，包括参与细胞周期转换、DNA损伤和细胞死亡过程的基因，都处于昼夜节律控制之下，因此生物钟影响了细胞的分裂、分化、衰亡等生命历程^[2]。最近流行病学的研究将癌症与生物钟紊乱联系在了一起，长期轮班工作或者跨时区飞行的人群具有更高的癌症易感性，生物钟网络在肿瘤发生发展的过程中起到了十分关键的作用^[3]，因此在本文中作者对慢性时差与癌症易感性之间的关系进行了研究，揭示了昼夜节律紊乱促进肿瘤增殖的分子生物学机制。

——结果——

为了研究慢性时差所带来的生物钟紊乱对肿瘤增殖的影响，作者构建了节律正常和慢性时差的小鼠模型，即LD组：正常的光暗条件LD12:12（白天12小时黑暗12小时），CJL组：每隔两天光暗周期前移6h（类似于人的跨时区飞行），使两组小鼠分别在该环境中适应三周，随后皮下接种黑色素瘤B16细胞，比较节律正常与节律紊乱小鼠的肿瘤增殖速率。令人惊讶的是，与LD组相比，CJL组小鼠肿瘤增殖速度显著增加（图1A），并且有着更高的致死率（图1B），除此之外，肿瘤的潜伏期也更短，大约15天左右即可在小鼠内成瘤（图1C）。

图1. 在LD和CJL条件下接种黑素瘤细胞系B16小鼠的肿瘤大小（A），存活率（B）和肿瘤潜伏期（C）。

由于肿瘤免疫微环境对于肿瘤的生长至关重要，作者猜测昼夜节律紊乱可能会影响肿瘤微环境中各种免疫细胞的比例，使之有利于肿瘤的增殖，接下来作者检测了24小时中4个不同时刻（白天（ZT3、ZT9），夜间（ZT15、ZT21））小鼠肿瘤浸润免疫细胞的百分比，总巨噬细胞的比例在两组小鼠间没有明显差异，但有趣的是，M1和M2两种巨噬细胞在不同时刻的水平发生了显著变化，CJL组小鼠M1肿瘤浸润的巨噬细胞在白天和夜间的水平被逆转，白天处于更高的水平（图2A），而M2巨噬细胞在白天的水平也出现了显著降低，并且节律性丧失（图2B），M1/M2的比例出现了相位逆转并且在夜间水平出现了明显降低（图2C）。而在肿瘤发生的过程中，M1型巨噬细胞具有杀伤肿瘤细胞的作用，而M2型巨噬细胞却能促进肿瘤的生长、发展、侵袭和转移，这些表明，CJL组小鼠的免疫微环境转变为以M2型巨噬细胞介导的免疫抑制为主的状态。随后，作者又继续检测了肿瘤中炎性细胞因子白介素-1β和白介素-6（IL-1β和IL-6）和肿瘤坏死因子-α的水平。结果发现IL-1β和IL-6的节律性振荡在CJL组小鼠中大幅减弱（图2D,E）。而TNF-α虽然在每日周期中保持着不同的表达水平，CJL组小鼠的振荡模式相较于LD组处于一种反相状态（图2F）。以上结果都表明，昼夜节律破坏会诱导肿瘤免疫微环境发生重要变化，进而促进了肿瘤的生长。

图2. 慢性时差（CJL）对肿瘤浸润的免疫细胞与细胞因子的影响。流式细胞术检测到的肿瘤组织样本中M1型巨噬细胞（A）和M2型（B）M1型/M2型百分比（C）ELISA测定的肿瘤组织样品中IL-1β（D），IL-6（E）和TNF-α（F）的蛋白质水平。

为了进一步揭示宿主生物钟对肿瘤生长的影响，作者检测了小鼠外周组织肝脏中核心生物钟基因Bmal1和Cry1的振荡表达模式，结果发现LD组小鼠Bmal1和Cry1的mRNA表达水平具有节律性的振荡，而CJL组小鼠的表达模式相较于LD组有很大差别，节律性振荡减弱，表明肝脏昼夜节律发生了改变（图3）。

图3. 小鼠肝脏中Bmal1（A，C）和Cry1（B，D）的mRNA表达水平。

接下来作者也检测了肿瘤组织中生物钟基因的表达情况，发现在LD组和CJL组小鼠中，Bmal1和Cry1基因的表达均未显示出节律性（图4），肿瘤组织中的生物钟是被破坏的，这也暗示生物钟控制基因（涉及细胞周期、细胞代谢等）的失调，促使细胞失控进一步恶化无限增殖。

图4. 小鼠肿瘤组织中Bmal1（A，C）和Cry1（B，D）的mRNA表达水平。

——小结——

本文发现昼夜节律的破坏可以通过调节免疫应答来促进肿瘤的生长。当昼夜节律紊乱时，肿瘤免疫应答的昼夜节律模式发生了改变，在CJL小鼠中，M1型细胞（和M1/M2比率）的减少将使稳态平衡朝着更具有耐受性的免疫特征发展，从而促进肿瘤免疫逃逸和肿瘤发生发展。并且CJL组小鼠的生物钟基因表达模式也发生了紊乱，从而引发下游钟控基因的失调促进肿瘤的发生。本文在一定程度上解释了慢性时差人群肿瘤高发生率的原因，并说明生物节律在肿瘤的治疗中有很大影响，时钟疗法或许是未来癌症治疗的一个新方向。

参考文献：

[1] Aiello I. et al. Circadian disruption promotes tumor-immune microenvironment remodeling favoring tumor cell proliferation. Sci Adv. 2020 Oct 14;6(42):eaaz4530.

Doi:10.1126/sciadv.aaz4530.

[2] Takahashi J.S. et al. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. 2017 Mar; 18(3):164-179.

Doi:10.1038/nrg.2016.150.

[3] Golombek D. A. et al. The times they're a-changing: effects of circadian desynchronization on physiology and disease. J Physiol Paris. 2013 Sep;107(4):310-22.

Doi:10.1016/j.jphysparis.2013.03.007.