开发可以迅速制作精子卵子基础细胞的大鼠多能干细胞的培养方法 —作为高效的生殖细胞制作方法，期待在生殖医学研究和畜牧业中的应用

2023年7月28日

发表要点

◆成功开发出了从着床于子宫后的受精卵中高效且稳定地制备大鼠的被称为外胚叶干细胞的多能干细胞的新培养方法。

◆被建立的外胚叶干细胞能够迅速地制造出精子·卵子的根源——始原生殖细胞，通过对由该始原生殖细胞制造的精子进行显微受精，成功地获得了健康的产仔。

◆本研究成果有可能有助于阐明妊娠初期，特别是着床前后受精卵发展的相关机制，并有望对生殖医学研究和畜牧业有所贡献。

   本成果の概要
 

発表概要

　东京大学医科学研究所干细胞治疗研究中心再生发生学领域的小林俊宽特任副教授、岩月研祐日本学术振兴会特别研究员等的研究小组，在与自然科学研究机构生理学研究所的平林真澄副教授、信州大学纤维系的保地真一教授、奈良县立医科大学、京都大学、剑桥大学的研究小组的国际共同研究中，使用了大鼠， 成功开发出了从着床于子宫后的受精卵中高效且稳定地制备被称为外胚叶干细胞(注1 )的多能干细胞(注2 )的新培养方法。 研究表明，与此前的方法相比，这个被建立的外胚叶干细胞可以在更短的时间内制造出成为精子·卵子原型的始原生殖细胞(注3 )，并且通过使由该始原生殖细胞制造的精子受精可以获得健康的产仔。 迄今为止的研究中，有从在小鼠大鼠着床前的受精卵建立的ES细胞(注4 )和性质与其相近的iPS细胞(注5 )制造出具有同样受精能力的始原生殖细胞的研究，但从着床后的受精卵产生的外胚叶干细胞是世界上首次的成果。 特别是外胚叶干细胞，已知其性质与人和其他动物中通常制造的ES细胞、iPS细胞具有非常接近的性质。 因此，利用大鼠作为模型的本研究成果，有望为阐明包括人在内的哺乳类动物在怀孕初期，特别是着床前后受精卵发展的相关机制，以及通过多能干细胞制造生殖细胞的生殖医学研究和畜牧业的未来应用做出贡献。 此外，本研究成果将于2023年7月27日(美国东部夏令时)刊登在国际科学杂志《Cell Reports Methods》的在线版上。

発表内容

<研究背景>
　近年来，利用包括人在内的各种动物的多能干细胞在试管内制造精子、卵子等生殖细胞的研究正在蓬勃开展。 本研究小组也通过模仿受精卵的发展，对大鼠的ES细胞进行阶段性的刺激，成功地创造出了始原生殖细胞( Oikawa et al .，Science 2022 )。 包括这一成果在内，到目前为止，在试管内制造出可以用老鼠这2种动物受精的精子和卵子的始原生殖细胞已经成为可能。 利用人和其他动物进行的研究也逐渐有可能制造出同样的始原生殖细胞，但它们能否成为具有受精能力的精子和卵子，其评价在技术上和伦理上存在困难，目前还处于谜团中。 另一方面，包括老鼠在内的啮齿类动物和包括人在内的啮齿类以外的动物之间，ES细胞和iPS细胞等多能干细胞的性质被认为存在差异。 一般来说，啮齿类动物的多能干细胞具有接近着床前受精卵的性质，而啮齿类动物以外的动物的多能干细胞具有接近着床后受精卵的性质。 因此，由具有接近着床后受精卵性质的多能干细胞制成的始原生殖细胞能否成为精子和卵子尚不清楚。 因此，本研究决定利用可以评价受精能力的大鼠，开发出制造具有接近着床后受精卵性质的多能干细胞——外胚叶干细胞的培养体系，在明确其特征的同时，验证能否从中制造生殖细胞。<研究内容>
①大鼠外胚叶干细胞培养方法的建立 从大鼠着床后的受精卵中提取一组被称为外胚叶的多能细胞，使用培养小鼠外胚叶干细胞所需的含有活动蛋白-A和bFGF细胞因子的培养液进行培养，外胚叶会自然地细胞死亡或分化成其他细胞，无法作为多能干细胞稳定培养。因此，向培养基中持续添加已知抑制细胞死亡的ROCK信号抑制剂( Y27632 )和已知具有抑制自发分化效果的Wnt信号抑制剂( IWP2，XAV939 )这一低分子化合物时，发现存在高增殖性和均匀的未分化性(注6 ) 在确认了建立的大鼠外胚叶干细胞的基因表达后，明确了与着床前的受精卵相比，具有更接近来源于着床后受精卵的特征。 该特征还表明，将山中因子(注7 )之一Klf4基因导入大鼠外胚叶干细胞后，可以恢复到接近着床前受精卵的状态，即初始化。 接下来，为了评估其多样性，我们将干细胞移植到了免疫缺陷小鼠的睾丸中。 于是，几个月后，明确了以干细胞为起源，可以形成含有构成身体的各种各样的细胞/组织的畸胎瘤(注8 )。 由此可知，具有与来源于外胚叶干细胞的着床后受精卵的外胚叶相近的特征，可以在保持能够制造各种细胞的能力=多功能性的同时，在试管中进行培养(图1B )。

图1 :大鼠外胚叶干细胞未分化性及多能性评估
a .建立的外胚叶干细胞均匀表达未分化标记( SOX2、OTX2、OCT3/4)。 b .移植于免疫缺陷小鼠睾丸的外胚叶干细胞形成的畸胎瘤的组织切片图谱。 观察到变成了表皮、腺组织、肌肉等各种各样的组织。
②大鼠外胚叶干细胞产生始原生殖细胞 接下来，我们验证了能否从大鼠外胚叶干细胞中制造原始生殖细胞。 将约10000个大鼠外胚叶干细胞制成团子状的块，在其中加入对制作始原生殖细胞很重要的被称为BMP4的细胞因子进行培养。 约3天后，发现可以以团块中约20%左右的比例制作始原生殖细胞(图2A )。 该始原生殖细胞显示出与以前本研究小组报告的由ES细胞诱导的始原生殖细胞同样的基因表达模式，由此表明两者非常接近。 另外，将来自大鼠表皮干细胞的始原生殖细胞移植到不能产生精子的大鼠的睾丸后，在移植后约2-3个月，在睾丸的一部分中发现了精子及精子细胞(注9 )的形成(图2B )。 为了验证这种来自大鼠胚胎干细胞的精子细胞是否具有授精制造个体的能力，将其显微授精到大鼠未受精卵中，移植到雌性大鼠的输卵管中，即可发育成正常的产仔(图2C )。 以上结果表明，在BMP刺激下，直接从大鼠胚胎干细胞中产生的原始生殖细胞具有正常的功能，有利于健康个体的诞生。　　

图2 :由大鼠外胚叶干细胞制备的生殖细胞和来自它们的产仔

a .从外胚叶干细胞制备的原始生殖细胞的照片。 部分团块为始原生殖细胞(红光)。 b .原始生殖细胞移植2-3个月后睾丸照片。 精子形成发生的地方显示绿色荧光，从组织切片像中发现有不成熟的生殖细胞( DDX4 :水色)及精子精子细胞( PNA :红)的存在。 将从C. B回收的精子细胞显微授精到大鼠未受精卵而得到的大鼠产仔。 之后，健康地成长为成体。

<今后的展望>

通过本研究，从大鼠着床后的外胚叶中建立的外胚叶干细胞，可以在3天的短时间内制造出精子、卵子的根源——始原生殖细胞。 到目前为止，我们的方法使用的是与着床前受精卵相近的ES细胞，因此，我们通过两个步骤制备了始原生殖细胞:先用2-3天使ES细胞变化到与着床后受精卵的状态相近的状态，然后再刺激3天。 因此，此次使用细胞的方法能够将培养所需的时间缩短约一半。 另外，由于无需经过阶段的工夫就可以制造出始原生殖细胞，因此适用于需要大量生殖细胞的分析和药剂的筛选，可以期待对生殖医学研究做出巨大的贡献。 而且，在这次的研究中，首次使用了由接近着床后受精卵的多能干细胞之一的外胚叶干细胞制成的始原生殖细胞，成功地获得了精子·精子细胞以及来自它们的健康产仔。 这暗示着从具有接近着床后受精卵性质的人和其他动物的多能干细胞制成的始原生殖细胞也有可能完全生成精子和卵子，今后的生殖医学研究以及为畜牧业做出贡献的生殖细胞制作技术的开发有望进一步发展。

<相关新闻发布会>

「ラット多能性幹細胞から精子・卵子の元になる細胞を作ることに成功 – 畜産業や医学研究への実用化に一歩前進 -」（2022/4/8）“从大鼠多能干细胞中成功制造出精子·卵子的基础细胞–向畜牧业和医学研究的实用化迈出了一步-”( 2022/4/8 )

https://www.ims.u-tokyo.ac.jp/imsut/content/000006110.pdf

主讲人　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　 　　

东京大学医科学研究所再生发生学领域 小林俊宽(特任副教授) <自然科学研究机构生理学研究所基因改造动物制作室(副教授(兼任) ) > 自然科学研究机构生理学研究所基因改造动物制作室 平林真澄(副教授) 信州大学纤维学部应用生物科学科 保地真一(教授)

论文信息　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　 　　

<杂志>小区报告方法 <题名>rat post-implantation epi blast-derived pluripotent stem cells produce functional germ cells <作者>Kenyu Iwatsuki，Mami Oikawa，Hisato Kobayashi，Christopher A. Penfold，Makoto Sanbo，Takuya Yamamoto，Shinichi Hochi，ki *责任作者 <doi>10.1016/j.crmeth.2023.100542 < URL > https://doi.org/10.1016/j.crmeth.2023.100542

研究资助

本研究包括科研经费“新学术领域研究(研究领域提案型) (课题编号: 18H05548 )”、AMED“再生医疗实现据点网络程序(再生细胞医疗基因治疗研究开发课题(基础应用研究课题) ) (课题编号: 22bm1123008h0001 )” 在公益财团法人住友财团“基础科学研究资助(课题编号: 210348 )”、公益财团法人第一三共生命科学研究振兴财团“PI设置研究资助”等的支持下实施。

用語解説

(注1 )外胚叶干细胞 着床于子宫后的受精卵，特别是具有未分化性(注6 )的细胞群体，称为外胚叶，可以在试管内培养制造。 可以在与人的ES细胞同样的培养条件(含有激活素-A和bFGF的培养基等)下建立，显示出与该细胞相似的形态和性质。 (注2 )多能干细胞 兼具试管内无限增殖性和能成为身体所有细胞的多功能性的细胞。 代表性的有胚胎干细胞( ES细胞)和人工多能干细胞( iPS细胞)。 (注3 )始原生殖细胞 怀孕初期的胚胎中产生的精子卵子的基础细胞。 在小鼠大鼠受精约1周后，在人类约2周后出现。 (注4 ) ES细胞 是胚胎干细胞( Embryonic Stem Cell )的简称，是代表性的多能干细胞之一。 可以通过在试管内培养着床发生在子宫之前的受精卵(尤指胚盘细胞)来制备。 (注5 ) iPS细胞 人工多能干细胞( induced Pluripotent Stem Cell )简称代表多能干细胞的一种。 可以通过向皮肤细胞等体细胞导入山中因子(注7 )来制造。 (注6 )未分化性 细胞没有决定成为哪个细胞种类的状态性质。 着床前受精卵胚盘细胞内部的团块(内部细胞团)和着床后受精卵中被称为“外胚叶”的部分具有这一性质，处于可以制造构成身体的所有细胞的状态。 (注7 )山中因子 京都大学山中伸弥教授首先发现的iPS细胞所需的4个基因( Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4 )统称为山中因子。 (注8 )畸胎瘤畸胎瘤。 多能干细胞的研究表明，这是一种未分化的细胞无序分化为构成机体的各种细胞/组织的肿瘤，可用于多能干细胞的研究。 (注9 )精子及精子细胞 在精巢内结束减数分裂的生殖细胞中，每一个都有半数的染色体。 精子细胞再经过变态，形成蝌蚪尾巴一样的尾部，就会变成成熟的精子。

咨询方式

<研究相关咨询>
东京大学医科学研究所再生发生学领域特任副教授小林俊宽    
<报道相关咨询>
东京大学医科学研究所项目协调员室(宣传) 自然科学研究机构生理学研究所研究力强化战略室 信州大学纤维学部总务组总务工作