酵母双杂交（yeast two-hybrid, Y2H）实验是筛选、验证蛋白-蛋白相互作用的强大工具，广泛应用于植物分子和生理学研究。使用酵母双杂点对点验证蛋白-蛋白相互作用的时候，首先会将携带AD和BD的质粒共转化酵母感受态细胞，然后在-leu/-trp双营养缺陷型平板（double drop out, DDO，以GAL4酵母双杂系统为例）上筛选阳性克隆。大约3~5天后阳性克隆长出，此时就可以挑选单克隆进行梯度稀释后，点到三缺陷（TDO）、甚至四缺陷（QDO）平板上验证相互作用。此时就会遇到一个严酷的问题，需要挑选几个单克隆进行梯度稀释和互作验证呢？不少人都会挑选至少两个到4个、甚至8个、16个克隆，然后再根据单菌落存活的比例来决定蛋白是否有相互作用，例如16个克隆里有10个克隆成功在QDO上生长，超过了一半，所以认为二者有相互作用。实际上通过这样的方式来判定是否相互作用，不仅浪费时间浪费试剂，而且也不科学。今天给大家介绍通过菌落颜色快速判断蛋白是否有相互作用的方法。常用的酵母双杂菌株AH109和Y2H Gold等，都携带一个腺嘌呤代谢突变ade2。当平板上没有额外提供腺嘌呤时，被阻断的代谢流会积累代谢中间体AIR，AIR能够进一步代谢成红色的化合物并积累在液泡中，使得菌落呈现红色。当蛋白-蛋白之间发生相互作用时，GAL4系统就会激活另外一个拷贝的ADE2基因用于合成腺嘌呤，使得酵母能够在腺嘌呤缺陷的QDO平板上生存，同时由于积累的红色色素减少，菌落的颜色也会变浅。酵母菌的这个特点在菌种鉴定中非常有用，这也是为什么划线恢复菌种、液体培养扩增菌种的时候都不应该在YPD培养基中额外添加腺嘌呤（即YPDA培养基）而应该只使用YPD培养基。只有在YPD培养基上培养3天后呈现深红色的大菌落（直径2 mm以上）才是正确的AH109或者Y2H Gold菌种。
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同理，当AD和BD共转感受态之后，会先在DDO平板上筛选，但是DDO培养基所含的腺嘌呤是非常有限的，所以共转化后蛋白是否发生相互作用将会决定菌落的颜色。下图是星光拟南芥的真实照片，左图的DDO平板上绝大多数克隆都呈现浅粉色大菌落，这就意味着这一对蛋白有非常大的可能发生相互作用。相反，右边这块板上的克隆绝大多数都是深红色，只有极少数（红色三角）是浅色菌落，说明这一对蛋白大概率不能发生相互作用。这就相当于是免费的、不用提供昂贵底物的X-α-Gal蓝白斑实验，不用白不用。后续的实验也表明，所有呈现浅粉色的菌落都至少能在TDO平板上存活，QDO是否能生长非常考验蛋白互作的强度，弱一些的相互作用即使菌落不呈现深红色，有时候也很难在QDO上生长。但菌落的颜色至少提供了一个非常快速且准确的、判断阴性互作的方法，因为深红色的菌落是绝对不能在TQO、QDO平板上生长的。一次转化至少能长几百个克隆，通过这种方法判断是否互作，要比随机挑选几个、十几个克隆准确多了，作图的时候只要挑出一个克隆作为代表就可以了。当然，如果你非要从一堆深红色的克隆中挑出那一个粉色的克隆用来代表这一对互作的话（例如，做实验前已经认定这一对要互作），我只想说，盆友，你这个思想很危险。不真实的报告绝大多数不能互作的事实，选择性地展示数据，这就是学术不端。另外我们在划线菌种或者转化涂板的时候，会有较低的概率（0.5~5%）在一堆红色大菌落中看到白色的微小菌落（左图黑色箭头），这并不代表菌种被污染了，而是酵母菌自发发生的RD突变（Respiratory-Deficient Mutantion），是非常正常的现象，挑单克隆时注意不要挑到这些菌落即可。
