《复旦大学》 2010年加入收藏 获取最新高密度脂蛋白对动脉粥样硬化抵抗作用及其机制
陈晓春【摘要】：血脂代谢紊乱是动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)最重要的危险因素之一。低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)升高可以显著增加冠心病的发病率和死亡率,而高密度脂蛋白(High-densitylipoprotein,HDL)具有抵制人类动脉粥样硬化发生的作用。因此,深入研究HDL对动脉粥样硬化发生的抵制作用及其机制具有重要的理论意义和临床实用价值。 快速、高效建立AS模型是实现人类AS疾病深入研究的基础,大鼠系哺乳动物,与人类有很多相似之处,易获得,成本低,成功建立大鼠AS模型非常重要。但是,由于大鼠自身具有抗动脉粥样硬化作用,所以,优化大鼠AS模型方法,是完成本课题的关键。本研究通过改良高脂喂养配方,改用人冠状动脉交换球囊有效损伤大鼠胸腹主动脉,同时给与维生素D3(VitD3)肌注进行钙超载干预,在最短时间内成功创建了高脂血症模型和典型的主动脉AS模型,同时伴有大鼠脂肪性肝病,肾病及肺炎改变。 本研究又利用大鼠天然高血清HDL和极低LDL水平的血脂条件进行整体实验,经过随机分组,观察单纯高脂喂养造模,单纯球囊损伤造模和以及二者联合造模对AS形成的影响,结果发现：大鼠先天高HDL水平在一定时限内能抵御高LDL水平的致AS作用；HDL具有促进受损血管局部三磷酸腺苷结合盒转运子(ATP binding cassette transporter A1, ABCA1)表达和促进斑块内胆固醇逆转运作用,损伤及高脂干预后受损血管内膜单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、血管间粘附分子-1 (Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)表达明显增强。 载脂蛋白-Ⅰ(Apolipoprotein A-Ⅰ, ApoA-Ⅰ)是HDL的主要成分,本实验利用佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)和氧化型低密度脂蛋白(Oxidative-low density lipoprotein, ox-LDL)干预人急性单核细胞白血病细胞株(THP-1)并成功诱导其分化为泡沫细胞,体外实验发现：ApoA-Ⅰ促进泡沫细胞胆固醇流出和ABCA1蛋白的表达,呈时间和剂量依赖关系,而且ApoA-Ⅰ具有降低泡沫细胞MCP-1、VCAM-1表达的作用。ApoA-Ⅰ抗炎作用可能与ABCA1的作用相关。 第一部分大鼠高脂血症模型建立和动脉粥样硬化模型创建方法优化 目的：探索成功快速建立大鼠高脂血症模型和AS模型的更好方法 方法：1.优化高脂饲料配方,选(Sprague-Dawley, SD)大鼠16只进行AS造模,高脂喂养7周。另选8只SD大鼠以正常基础饲料喂养作为对照。高脂喂养前,喂养后3和7周,分别禁食水10h,在氯胺酮(10mg/kg体重)腹腔麻醉条件下,抽取静脉血1ml检测血脂。2.将AS造模组16只大鼠高脂喂养1w后,用人经皮冠状动脉腔内成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTC A)球囊导管进行胸腹主动脉损伤,建立胸腹主动脉损伤模型。3.AS造模大鼠在高脂喂养前当日右下肢一次性肌注VitD360万U/kg体重,导致大鼠钙超载。4.取造模组术后1周胸腹主动脉做扫描电镜和光镜检查,术后2周和6周取近膈段胸主动脉多聚甲醛固定,制作石蜡切片,HE染色,做组织形态学分析,同时,取术后6周造模组大鼠肝脏、肺脏和肾脏,了解脂肪沉积情况。 结果：1.AS造模组大鼠高脂喂养后,血脂总胆固醇(Total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)均有不同程度升高,呈时间依赖性,其中以TC和LDL-C增高为著,喂养后7w,TC水平较喂养前增高10倍以上,LDL-C较喂养前增高达70倍。而HDL-C和甘油三酯(Triglyceride,TG)则轻度增高,高脂喂养后3w, HDL-C增高不明显,7周血清HDL-C水平才明显增高,与高脂喂养前相比,差异具有统计学意义(P0.05)。2.AS造模组球囊损伤后1周,扫描电镜观察见大部分血管内皮细胞损伤,内膜被剥脱,血管基底膜胶原暴露,并可见散在血小板粘附在胶原表面。内皮损伤从主动脉弓下1cm至腹主动脉手术切口处,长约6cm。光镜下观察主动脉严重受损,术后2周见新生内膜纤维性斑块形成。术后6周,见典型动脉粥样硬化斑块形成。3.AS造模组高脂喂养后7周,大鼠肝脏、肺脏和肾脏均发生肉眼可见大体形态改变,分别由紫红色、粉红色、褐色转变为黄绿色,光镜下肺脏、肝脏和肾脏均有脂肪沉积,脂肪变性和间质毛细血管淤血改变。 结论：1.大鼠经改良的高脂饲料配方喂养7周可成功创建高脂血症模型,使大鼠由以HDL-C为主的血脂成分翻转为以LDL-C为主的血脂状态,HDL-C/LDL-C逐渐下降,为高胆固醇血症导致血管氧化应激损伤,启动AS的发生、发展创造条件。2.大鼠胸腹主动脉经高脂喂养,钙超载和血管内膜有效损伤6周,可成功建立大鼠动脉粥样硬化模型。 第二部分大鼠高密度脂蛋白对动脉粥样硬化的抵抗及可能机制 目的：探讨大鼠HDL对动脉粥样硬化的抵抗及产生机制 方法：1.SD大鼠被随机分为正常对照组、高脂喂养组(简称高脂组)、血管损伤组(简称损伤组)以及高脂喂养加血管损伤组(简称高脂损伤组)。高脂饲料喂养7周建立高脂血症模型并动态监测血脂变化。2.利用第一部分创建的大鼠胸腹主动脉PTCA球囊损伤方法进行血管损伤,3.术后2周、6周取胸主动脉近膈段做石蜡切片,HE染色,在Leica显微镜下采集图像,做组织形态学分析。同时做胸主动脉平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin, a-SMA)、增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen PCNA). ABCA1、MCP-1和VCAM-1的免疫组织化学分析。利用photoshop图像处理系统,分析各组阳性表达区域颜色的灰度值,做半定量分析。 结果：1.高脂组高脂喂养后出现血脂成分明显翻转,术后2w和6w血清HDL-C/LDL-C由高脂喂养前的5.50降至0.55及0.29,差异有统计学意义(P0.01),血清LDL-C也由高脂喂养前0.23±0.07mmol/L增至2.99±1.08mmol/L和16.77±2.59mmol/L(P0.01), HDL-C和TG呈轻度升高。损伤高脂组血脂发生类似变化,与高脂组相比无统计学差别。损伤组血脂与正常对照组相比无明显变化,提示大鼠血脂的变化由高脂喂养导致,血管损伤未加重血脂的紊乱。2.术后2w,损伤组和损伤高脂组均可见胸主动脉内弹力板断裂,中膜较正常对照组明显增厚及新生内膜形成,高脂组内膜表面光滑,与正常对照组相比无显著性差异。术后6w,损伤组和损伤高脂组新生内膜增厚明显,前者见明显纤维斑块形成,而后者则可见典型AS斑块形成,二者管腔面积均缩小,但在内膜／中膜面积百分比(%)、管腔面积狭窄率(%)之间无统计学差别。高脂组内膜表面欠光滑,见炎症细胞粘附在内膜表面,由此提示单纯高脂血症和钙超载可引起血管内膜的氧化应激损伤和炎症细胞粘附,内皮剥脱和血管壁损伤是引起血管重塑和新生内膜形成的关键因素。术后6w,未见机械损伤和高脂血症氧化应激损伤导致内膜增生和血管重塑的协同作用。3.术后2w,高脂组内膜、损伤组新生内膜a-SMA和PCNA表达均较正常对照组增强,损伤高脂组新生内膜a-SMA和PCNA表达与损伤组相比无统计学差异。高脂组和损伤组MCP-1, VCAM-1和ABCA1表达,均明显高于正常对照组,均P0.05；同时发现高脂损伤组MCP-1, VCAM-1和ABCA1表达显著高于高脂组和损伤组,均P0.05；损伤组MCP-1, VCAM-1表达强于高脂组,而ABCA1表达弱于高脂组,均P0.05。 结论：1.大鼠具有很高的血清HDL储备,高脂饲料喂养后,尽管血清LDL-C水平很高,但HDL-C与LDL-C比率仍使大鼠动脉处于HDL保护状态。2.高脂血症和血管机械损伤均可促进血管炎症发生,并且二者具有协同作用,但未发现在促进受损血管收缩性重塑和新生内膜增生方面的叠加作用。3.高脂因素促进ABCA1表达明显强于机械损伤,大鼠高HDL储备抵抗AS加重的机制可能与促进受损血管ABCA1表达,促进负脂细胞胆固醇逆转运有关。4.高表达的ABCA1和HDL可能具有抗炎作用。 第三部分ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞源泡沫细胞模型的建立 目的：探索THP-1巨噬细胞源泡沫细胞模型创建的可靠方法方法：1.巨噬细胞和泡沫细胞的诱导分化：THP-1细胞株接种在含有10%胎牛血清RPMI 1640培养基的培养瓶中置于37℃5%CO2孵箱中培养,倍增时间为48h,THP-1呈悬浮生长。然后,以105/ml的细胞密度接种到预置盖玻片的6孔板中培养,用50ng/ml的佛玻脂(phorbol 12-myristate lipoprotein, PMA)干预THP-1细胞48h,使其由单核细胞分化为巨噬细胞。然后,再用含氧化型低密度脂蛋白(Oxidative-low density lipoprotein, ox-LDL) (50μg/ml)的RPMI 1640培养液干预48h,使THP-1源巨噬细胞被诱导分化为泡沫细胞。2.泡沫细胞鉴定,利用油红“O”染色和氧化酶法细胞内胆固醇含量的测定,进行泡沫细胞定性和定量分析。3.免疫荧光染色进行巨噬细胞、泡沫细胞ABCAI, MCP-1, VCAM-1测定。 结果：1.经PMA (50ng/ml)干预THP-1细胞48h后,细胞由圆形悬浮状聚集生长逐渐呈现出贴壁生长,形态变为多角形或长梭形,伸出伪足,当巨噬细胞再经ox-LDL(50μg/ml)干预24-48h后,细胞体积逐渐增大,形态变得更加不规则,胞浆内可见较多脂滴颗粒,由于细胞浆内大量脂滴,甚至,将细胞核被挤到一侧,符合泡沫细胞形态特点。2.油红“O”染色见泡沫细胞内有大量红色颗粒状脂滴,ox-LDL(50μg/ml)诱导组油红“O”染色阳性细胞数量明显高于未诱导组p0.05。ox-LDL诱导组,细胞内胆固醇含量明显高于未诱导组(423.17 mg/g蛋白±11.76mg/g蛋白vs 226.70mg/g蛋白±10.36 mg/g蛋白,p0.05)。胆固醇脂也显著高于未诱导组(254mg/g蛋白±16.08 mg/g蛋白vs 84.86mg/g蛋白±6.23mg/g蛋白,p0.05),诱导组细胞内胆固醇脂与胆固醇比值达60%以上,提示泡沫细胞形成。3.免疫荧光染色发现,巨噬细胞经ox-LDL诱导48h之后,细胞内ABCA1表达较未诱导组明显增多,而且炎症因子MCP-1和VCAM-1表达也呈现明显增多,由此提示THP-1源巨噬细胞转变为泡沫细胞后,细胞膜上ABCA1的表达明显增强,同时刺激泡沫细胞发生氧化应激反应,合成炎症因子MCP-1和VCAM-1增多。 结论：1.50ng/ml PMA干预THP-1细胞48h,可使单核细胞诱导分化为巨噬细胞。2.50μg/ml ox-LDL干预巨噬细胞48h,使巨噬细胞负脂并成功分化为泡沫细胞。3.负脂的泡沫细胞促进了ABCA1的表达,并促进细胞内炎症因子MCP-1和VCAM-1的表达。 第四部分载脂蛋白AⅠ对泡沫细胞胆固醇流出及MCP-1、VCAM-1、ABCA1表达的影响 目的：探索HDL核心成分ApoAI对泡沫细胞胆固醇流出的影响以及是否对炎症因子MCP-1、VCAM-1表达产生影响,从而发挥抗炎作用 方法：以PMA(50ng/ml)及ox-LDL(50μg/ml)诱导人THP-.使其分化为负脂的泡沫细胞。以不同浓度apoA-I (5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml)孵育泡沫细胞24 h,以及apoA-I(10μg/ml)孵育泡沫细胞6 h、12 h、24 h；采用油红O染色观察细胞内脂滴的变化,用氧化酶法检测细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯的含量；以apoA-I (10μg/ml)或ABCA1抗体(10μg/ml)孵育泡沫细胞24h,用免疫荧光法检测巨噬细胞及经apoA-I及ABCA1抗体干预前后的泡沫细胞MCP-1、VCAM-1及ABCA1的表达。 结果1.THP-1经PMA和ox-LDL分别干预48小时后可以成功地被诱导为富含脂质的泡沫细胞。2. apoA-I可促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇流出,减少细胞内胆固醇含量,呈浓度依赖性和时间依赖性。3.随着apoAI干预浓度增加,THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内ABCAl mRNA的表达变化不显著,但蛋白表达增加,0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg /ml apoA I干预浓度下油红O染色阳性细胞率分别为(55±4)%与(43±9)%、(33±4)%、(28±1)%、(26+2)%。4. ABCA1抗体干预可以增加THP-1巨噬细胞源泡沫细胞ABCA1蛋白的表达5.经ox-LDL (50μg/ml)干预后,与巨噬细胞相比,泡沫细胞内MCP-1、VCAM-1及ABCA1表达均明显增强；经apoA I (10μg/ml)干预后,与未干预组相比泡沫细胞内MCP-1及VCAM-1表达显著减少(P均0.05),而ABCA1表达明显增加(P0.05)；经ABCA1抗体(10μg/ml)干预后,与未干预组相比,泡沫细胞内MCP-1和VCAM-1的表达明显增加。 结论：1.apoAI通过增加THP-1泡沫细胞ABCA1蛋白表达,促进细胞内胆固醇流出,并呈浓度和时间依赖关系,apoAI在ABCA1介导的胆固醇流出中发挥至关重要重用。2. apoA I抑制THP-1泡沫细胞MCP-1和VCAM-1蛋白表达,具有抗炎作用。3. ABCA1抗体干预泡沫细胞24h,细胞内MCP-1, VCAM-1表达显著增高,ABCA1可能直接参与抗炎作用。
【关键词】：
动脉粥样硬化 动脉狭窄 模型 动物 胆固醇逆转运 高密度脂蛋白 氧化型低密度脂蛋白 载脂蛋白【学位授予单位】：复旦大学
