1 液体活检的对象
液体活检的对象包括外泌体、CTC、ctDNA和cfDNA。CTC是前几年比较热门的循环肿瘤DNA，即释放到外周血的肿瘤细胞。ctDNA现在是研究的一个热点，也在临床上开始应用起来。外泌体现在还主要应用于科研，因为它携带的信息相对来说比较丰富，它可以携带蛋白、RNA的信息，在不同的肿瘤细胞之间起信息转导的作用，也可以用于肿瘤的早期诊断，外泌体将是液体活检发展的一个方向。
2 ctDNA和cfDNA的区别
cfDNA是包含了ctDNA的，cfDNA是所有的细胞，不管是正常细胞还是肿瘤细胞，释放入血的游离的DNA片段。ctDNA主要是指肿瘤细胞释放入血的游离DNA片段，它是存在基因突变的片段，它的片段相对来说是比较小，而且它的含量相对来说比较低，ctDNA一般占cfDNA的1%~10%。
3 临床样本中ctDNA的分布特点
ctDNA在很多肿瘤中都能被检测到，但是不同的肿瘤，血液中的ctDNA的含量是存在差异的。总的来说，ctDNA在晚期肿瘤中的含量是比较高的，在含有转移灶的肿瘤中，ctDNA的含量更高，ctDNA主要是和肿瘤的负荷相关。越晚期，又有转移灶的病人相对来说肿瘤的负荷越高，那ctDNA被检出的可能性就越大，它的含量就会更高。
4 ctDNA的发展史
早在1948年。发现了就人的血液中存在着游离核酸，但是直到1994年，才在癌症患者中发现了RAS基因的一个变异，ctDNA的重要性才得以在肿瘤患者中体现。由于检测技术的限制，ctDNA检测在当时并没有快速发展起来。在近十几年，ctDNA的文章大量涌现，一直到最近几年ctDNA检测灵敏度越来越高，越来越多地应用于临床。2017年这篇文章中被誉为液体活检时代的来临，ctDNA的临床实践时代真正来临。
5 ctDNA在晚期肺癌中的应用
对于晚期肺癌的患者来说，组织取得是比较困难的，而且小样本量是居多的，它更多的是局限于一些穿刺的样本，而且在晚期肺癌治疗中有很多的靶向药物，一旦进展之后，耐药机制也是比较复杂的。对耐药机制的探讨也是需要更多的样本来进行相关研究，对晚期治疗患者的疗效评估也需要ctDNA的解决。所以对于晚期肺癌的研究，主要集中在三个方面：（1）靶向治疗获得性耐药机制的探讨；（2）晚期治疗（放化疗、靶向治疗和免疫治疗）疗效动态评估和监测；（3）小标本的多基因检测。
6 靶向治疗获得性耐药机制
2013年，吴一龙教授提出了TKI获得性耐药不同的进展模式。它的进展模式包括暴发进展、缓慢行进展和局部进展。不同的进展模式，它有不同的治疗措施。
TKI耐药之后的几种进展模式的分子机制。一般情况下出现缓慢行进展，主要是由于出现T790M突变引起的，T790M突变主要是EGFR一代TKI耐药的主要机制。对于局部进展和快速全面进展的TKI耐药机制尚不清楚，需要更加进一步的研究。
肺癌全程治疗中，基因伴随诊断是越来越重要，但是相对来说组织的取得也是越来越困难。现在的组织检测是金标准，所以就有“Tissue is the issue”。对于晚期的患者来说，一线、二线和三线以上，患者的组织取得是越来越困难的，一线的患者可以有70%~80%有活检的结果可以用于诊断，到了二线和三线以上，取得组织的困难就越来越大，主要由于患者随着疾病的进展，体质越来越差，而且有更多的患者甚至取不到组织，所以这时就提出了“Tissue is the issue”。临床的主要困难也是由于没有足够的组织，无法知道基因的变异状态，所以没办法实现对晚期患者的精准治疗。
7 疗效动态监测
现在已经有很多的研究表明，ctDNA的变化可以反映靶向治疗、化疗、免疫治疗的疗效状态的变化。ctDNA的变化和EGFR TKI疗效呈现一定的相关性。我们可以看到，在这个红框的里面的数据，凡是治疗前和治疗后ctDNA的量发生了绝对变化的话，他在治疗疗效上都出现了PR或者CR的状态，那么我们可以看到，Case15这个患者，他治疗前后的ctDNA的含量并没有发生变化，他在疗效上也反映出了一个PD，就是疾病进展的状态。所以从这个研究我们可以看出，ctDNA的变化和EGFR TKI的疗效呈现一定的相关性。
血浆中提取的T790M突变的出现时间比影像学要平均提早4个月，最短的可以提前15天，最长的可以提前将近1年的时间，可以提示病灶在分子水平上的进展。
在化疗中也存在相同的情况。在化疗的第三个周期，如果ctDNA消失的患者，他的PFS和OS都较第三个周期ctDNA仍然阳性的患者呈现了显著的延长。
同样，ctDNA也可以用于免疫治疗的疗效监测。在这一篇文章中，10例接受PD-1单抗治疗的患者，如果在治疗第8周，ctDNA检测呈阴性的患者，那他持续的反应时间是比较长的，PFS和OS都呈现显著的延长。在中位的PFS，ctDNA阴性的这部分患者达到了11个月，阳性的患者只达到了2个月。PD-1单抗治疗后第8周ctDNA的检测是可以监测免疫治疗的疗效的。
晚期肺癌遇到的第三个问题就是小样本的一个多基因检测。
肺癌的精准治疗的路径依赖于更多的基因检测。现在越来越多的基因检测被应用于指南的推荐，这就意味着患者有越来越多的治疗机会。由于受限于组织检测，患者就会丧失相关的一些靶向治疗的机会，那么血检对于这一部分患者来说就越来越重要了。
晚期肺癌患者肿瘤组织的取得主要是通过穿刺活检取得，穿刺活检往往难以达到临床肿瘤精准医学诊断共识所明确的要求肿瘤细胞含量达20%以上，而且有的时候由于肿瘤的异质性，穿刺组织是难以反映整个肿瘤的负荷的。
8 思路迪VCAPS研究的思考
问题主要有以下四个方面：（1）ctDNA的检测与组织的一致性如何。因为我们都知道现在来说组织的检测是一个金标准，那ctDNA必须要跟组织达到一定的吻合度，我们才能更好地应用于临床；（2）ctDNA丰度是否可以像组织一样指导治疗。（3）低丰度的ctDNA在临床上有什么样的意义；（4）ctDNA是否可以替代组织基因检测。
ctDNA与组织检测的一致性。CtDNA的检测技术中，相对来说应用临床上比较成熟的检测技术主要是有DD-PCR，还有NGS测序。不同的技术其检测的灵敏度不一样。
随着ct-DNA检测技术的成熟，其检测灵敏度也越来越高，从2015年到2016年，它的灵敏度实现了一个质的突破，这也说明更好的说明，ct-DNA可以更好地应用于临床。
数字信号技术就是给每一条ct-DNA编上一个数字编码，就相当于每一条ct-DNA都有自己的“身份证号码”。这个“身份证号码”可以通过提高测序深度来增加它的有效数据。它的平均有效数据在5000层以上的话，就可以大大地提高灵敏度，也突破了90%这样一个灵敏度的瓶颈。
在2016年国际ct-DNA检测灵敏度进入了万分之一的时代，使用新一代的数字信号ct-DNA检测结果，可以看到ct-DNA的变异。最低的检测丰度可以达到万分之三，那平均的有效深度是都是在大于5000层到6000层以上。血液中ct-DNA 50%的丰度是低于4‰的。
VCAPS研究大约入组了187例患者，主要是检测晚期肺癌患者中血液ct-DNA基因变异的一致性研究。以下的一致性研究结果，我们可以看到，以EGFR为例的话，EGFR ct-DNA检测的灵敏度可以达到95%，特异性可以达到100%，其他的一些用药靶点的检测灵敏度可以达到95%以上。
ct-DNA的丰度是否可以像组织中的变异丰度一样指导治疗？
肺癌组织中，EGFR的丰度可以指导EGFR TKI的治疗。对于EGFR TKI来说，它的EGFR突变丰度越低，那TKI的疗效就越差。以上这两篇文章是分别是来自于吴一龙教授和日本学者的研究，对于组织中不同的突变丰度进行了分层分析，我们可以看到，EGFR的突变丰度越低，TKI疗效越差。
在VCAPS研究中，ct-DNA的突变丰度组织中的突变丰度并不一致，组织中的高丰度突变在对应的血液中往往以低丰度的形式存在。我们也进行了一个组a织中和血液中丰度一致性的分析，在这个一致性分析中，R值是0.48，说明组织中和血液中丰度的一致性是非常差的，90%的血液的ct-DNA的突变丰度是小于5%的，这么低的一个突变丰度，在临床上意味着什么？
同时我们也对于这种低丰度的突变进行了DD-PCR的验证，我们可以看到，ct-DNA的变异丰度和DD-PCR的变异丰度呈现了非常高度的一致性，也就是说我们测的非常低的这个变异丰度是真的存在的。另外一个方面也说明了，ct-DNA的变异丰度与组织变异丰度是不一致的，不能基于ct-DNA的变异丰度来指导TKI治疗。
大体上来讲，当组织中高丰度变异，就是5%以上，那对于对应的突变在血液中的检出率就会比较高，当组织中的变异丰度小于5%的话，在对应的血液中的检出率出现了大幅的下降，其检出率只有15%。
血液中的低丰度并不意味着组织的低丰度。当血液中的丰度低于2‰的突变，在组织中的丰度往往高于5%。我们可以看到上图右下角的这个表格中，在血液中EGF突变丰度只有1.2‰的情况下，在组织中的丰度可以达到22%。对于TSC1这个基因，我们同样可以看到这个情况，在血液中的突变丰度非常低，但是在组织中它的突变丰度是比较高的。也就是说，血检中只要检测出用药靶点的突变，那它就具有指导临床用药的价值。
9 ct-DNA是否可以替代组织进行基因检测？
ct-DNA的敏感性其实受到很多客观条件的影响。从VCAPS研究中，我们可以看到它的灵敏度在65%~93%之间分布。影响ct-DNA检出率的因素主要是包括以下几个方面：cf-DNA总量比较低，或者是患者正在接受治疗，或者说它在组织中的变异丰度小于5%。去除以上一些不良因素的影响的话，我们可以看到在晚期肺癌患者中，ct-DNA的检出敏感性可以达到92.25%。
相关研究指出，肿瘤患者的cf-DNA含量是高于健康人的，但是也有部分的肿瘤患者cf-DNA含量低于健康人的平均水平，这时会导致ct-DNA的检出率出现大幅下降。当cf-DNA在血浆的含量小于9 ng/mL时，ct-DNA检出率会出现一个大幅下降。
目前由VCAPS研究得出，ct-DNA目前还不能完全替代组织DNA的检测，但会是晚期肺癌患者组织基因检测的一个有力的补充。对于晚期肺癌患者，并且患者的cf-DNA含量大于10 ng/mL的话，采用新一代的数字信号ct-DNA检测技术，其敏感性可以达到90%，特异性可以达到100%，对于晚期的肺癌患者来说，这将是一个强有力的指导治疗的一个补充手段。
下图对ct-DNA检测中存在的一些思考做了一个总结。（1）ct-DNA与组织检测一致性如何？对于晚期的肺癌患者来说，如果cf-DNA含量大于10 ng/mL，它可以达到90%的一致性，并且EGFR变异的一致性可以超过95%。（2）ct-DNA丰度是否可以像组织中基因变异一样指导治疗？其实是不可以像组织丰度一样指导治疗，因为ct-DNA丰度没有反映组织变异丰度的情况。（3）低丰度ct-DNA是否有临床意义？有，因为所谓血液低丰度ct-DNA变异，其对应的组织中变异丰度并不一定低，并且含有众多药物靶点变异，所以低丰度ct-DNA可以指导临床治疗，并且可以动态监测相关药物的疗效。（4）ct-DNA是否可以替代组织基因检测？ct-DNA在有限的条件下可以取代组织基因检测，但是ct-DNA阴性的患者，其组织变异仍然有可能为阳性。
10 ct-DNA的送检样本要求及其流程
血检是一个无创检测，对于病人来说比较比较好接受，其取样和送检过程也比较简单。只需要在特定的含有cf-DNA保护液的试管中充入8~10 mL血液，轻轻摇晃均匀之后，使保护液和血液充分混合，在恒温的条件下直接送检就可以了。
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