中药保妇康栓对宫颈癌细胞抑制作用的分子机制研究
商宇红 白丽霞 魏丽惠
摘自《中国妇产科临床杂志》 2003年05期
【摘要】目的从细胞生物学及分子生物学水平;.探讨中药保妇康抗癌的作用机制。方法以小同浓度的含药培养液作用于感染HPV16的人宫颈癌细胞系—Si Ha细胞.并设立无药对照.通过细胞计数、MTT及流式细胞分析技术检测该药对细胞生长及增殖的影}}向;以RT—PCR法半定量检测对HPV16 E6E7基因表达的影响。结果经含有保妇康的培养液作用后.细胞数量减少.信增时间延长.细胞存活率降低;细胞周期齐时相中.S期所占比例减少; HPV16 E6E7 mRNA I均表达量减少。结论以莪术油为主要成分的保妇康不仅可以直接接抑制宫颈癌细胞的生长.并可能通过抑制HPV16 E6E7基因表达的分子机制.达到抑制肿瘤目的。
[关键词]保妇康:宫颈癌:人乳头状瘤病毒
'Ihe molecular mechanism of Baofukang suppository as a potential inhibitor for cervical carcinoma cell.
SHANG Yuhng .BAI Lixia .WEI Lihui.
(Department of Obstetrics and (gynecology .Peking University People's Hospital .Beijing 100044 .China)
[Abstract] Objective To investigate the rmlecular mechanism of Baofukang suppository.made from Chinese trade tional herbs .as a potential inhibitorfor cervical carcinoma cell growth. Methods The human cervical carcinoma cell line—Si Ha was cultured with different concentrations of the liquid form of Baofukang suppository.Cytometry.MTT assay and flow cytometry assay (FCM)were then used to monitor the growth and proliferation of the cell line. The expressions of HPV 16/E6E7 genes were simultaneously evaluated by reverse transcription—polymerase chain reaction (RT—PCR).Results Under the influence of Bao-fukang suppository which has Curcuma as main component .the growth of cells slowed down .the doubling time became longer and the livability of the cellsfell down with lesser cellsin the S state. At molecular level.decreased expressions of HPV16/E6 E7 mRNAs were observed. Conclusions Baofukang suppository can inhibit the cervical carcinoma celldirectly and also restrain the turmor by depressing the expression of HPV16/E6E7 genes.
[Key words] Baofukang suppository.cervical carcinoma.human papillomavirus ChinJ Clin Obstet Gynecol .2003 .4:336-338
中药莪术属姜科姜黄属植物，近年来的研究及临床应用表明，莪术具有抗肿瘤、增强免疫、抗菌及抗病毒等作用。临床实验证明，莪术油局部用药对宫颈糜烂及其病变有一定的疗效。本研究从细胞及分子水平探讨其抑制病毒复制及肿瘤生长的作用机制。
材料与方法
一、实验材料
1.实验药物:选用海南碧凯药业有限公司生产的保妇康栓，其卞要成分为莪术油，佐以冰片及基质等，生产批号02110682。以RPM1 I640全培养液稀释至所需浓度。
2.细胞培养:选用感染HPV16的人宫颈癌细胞系Si Ha细胞，于RPM1 I640全培养基中培养，其中含胎牛血清浓度为10 %，青霉素100 1CT/ml ,链霉素100 a g/ml，在恒温培养箱中以5 % CO2,37。(吸饱和湿度条件下传代培养。
二、实验方法
1.细胞生长曲线的绘制:取进入对数生长期的细胞接种于24孔板上((9 -10 X104个细胞/孔)，常规培养。接种次日分别加入稀释比例为1 :2 560 ,1 5 120 , 1 :10 240的含药培养液，其所含莪术油浓度分别为10ug/ml , 5ug/ml , 2.5ug/ml , 1.25ug/ml，培养24 h后，更换为不含药液的RPMl I640全a养液继续培养，并设正常对照，每48 h换液一。每24 h取4孔细胞计数，取均值，共计数6d，绘制细胞生长曲线。
2. MTT检测:以3 X104个/孔的细胞量接种于96孔培养板中，培养24 h后，加入不同浓度药液，每种浓度设立8个平行对照，并设正常对照及空白对照，置正常培养条件下培养。以含药培养液作用24 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 u 1，继续培养4 h，吸弃孔内培养基，每孔加入DMSO150 u1，振荡摇匀，10 min后选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪((Bil—Rad Model 550)上测定各孔吸光度(OD)值，并计算细胞存活率，即:细胞存活率=试验组吸光度值/对照组吸光度值X100%。
3.流式细胞仪检测细胞生长周期的变化:收集以不同浓度的含药培养液作用24 h及对照组细胞，80%冷乙醇固定，4℃过夜，PB S冲洗去除固定液，加入10 mg/ml的Rnase A溶液5 u1混匀，37 ℃孵育30 min，加入PI染液至终浓度25ug/ml，混匀，常温避光染色30 min后，以FACSort流式细胞仪进行荧光检测，ModFit LT软件分析细胞周期各时相的特点。
4. RT—PCR方法半定量研究HPV16—E6 E7表达的改变:取进入对数生长期的细胞，以不同浓度的含药培养液作用24 h后，以Triwl试剂盒提取细胞中的总RNA，经M—MLV逆转录酶反应体系逆转录为cDNA，参照文献[2]，HPV16一Fb E7及内参C}APDH PCR引物序列如下(上海申友生物技术公司合成):HPV 16—E6 E7的引物序列(扩增片段长度616 bp):上游5’TGACTTTGC'TTTTCGGCATT-3，下游5—GAGAACAACA CHATGGGGCACAC } ';内参GAPDH的引物序列(扩增片段长度307bp):上游5 '—CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3，下游5’AGCCTTCTCCATGGTGAA CAC—3 '。扩增条件:92℃预变性5 min;95℃变度性1 min，60℃退火1 mi n，72℃延伸1 min，共35个循环;72℃}延仲10 min。
以单纯加入内参引物扩增作为阴性对照。每一PCR反应至少重复3次。PCR产物分析:扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相，密度扫描分析仪测定吸光度(IOD)值。
二、统计学处理
采用单因素方差分析。
结果
一、对细胞生长及增殖的影响
1.对接种于24孔培养板的细胞逐日计数，统计结果显示以含药培养液作用24 h后，细胞数量较对照组明显减少(P < 0. 05) ,细胞倍增时问延长。其抑制程度随药物剂量改变，但差异无显著性(图1)。
2. MTT法检测各孔吸光度(OD )值，可见用药后各组吸光度值均较对照组明显降低(P<0. 05)，细胞存活率随药物浓度的升高而降低，但无统计学意义(表1)。
3.流式细胞仪检测细胞周期各时相的变化:实验组s期所占比例较对照组减少，其差异有显著性(P<0. 05，表2)。
一、对HPV16—E6 E7基因表达的影响经RT - PCR扩增并测定电泳条带吸光度值，计算HPV16—E6 E7与CIAPDH基因扩增片段的吸光度值之间的比值，可见与对照组相比，实验组HPV16—Fb E7 mRN}、的表达量降低(P<0.05，表
3，图2)，但与药物剂量无明显的线性关系。
讨论
莪术根茎含挥发油1%一1.5%,主要成分为多种倍半菇类，含莪术醇、莪术酮、莪术双酮等20余种化学成分。体外动物实验表明，莪术油对宫颈癌、肝癌等实体瘤的生长有较高的抑制率，局部用药后，肿瘤明显缩小。本实验中，通过绘制细胞生长曲线，观察到在不同浓度保妇康作用下，Si Ha细胞的生长周期较对照组明显减慢，并A随着剂量的递增，对细胞生长能力的抑制作用亦呈增
强趋势。通过MTT吸光度法检测细胞的增殖能力，亦证实在保妇康的作用下，宫颈癌细胞的增殖能力明显受到抑制，并存在着剂量效应关系。证实了该药对肿瘤细胞有抑制作用。
有文献报道，镜下观察在莪术醇作用下的宫颈癌、肉瘤等细胞，可见肿瘤细胞的核质比例减小，核外形趋于正常，染色质、核仁和染色质间颗粒减少，表明莪术醇对肿瘤细胞的代谢及分裂有抑制作用[11]。本研究通过流式细胞术检测显示，与对照组相比，用药组虽未出现明显的凋亡峰，但其处于s期的细胞所占比例明显低于对照组，说明在实验药物作用下，肿瘤细胞的DNA合成复制受到抑制，导致细胞的增殖分裂减慢。
作为最常见的女性生殖道恶性肿瘤，宫颈癌的发生与性传播疾病尤其是HPV感染密切相关，在宫颈癌组织中，HPV DNA的检出率可高达90 %[6] o
现己普遍认为，高危型HPV ( HPV 16 , 18 , 33型等)感染是引发宫颈癌的重要原因之一[7]}。病毒DNA将以E6 , E7为卞的基因片段整合到宿卞细胞的DNA中，通过激活调节病毒生长的E6 , E7基因片段，使之无限制地转录，导致宿卞细胞性质发生改变，发生永生化，甚至演变为恶性细胞。因此E6 , E7基因片段的表达活性与肿瘤细胞的增殖能力密切相关[8]。本实验中，通过RT—PCR半定量检测，发现保妇康作用后，Si Ha细胞中HPV 16 E6 ,E7基因片段mRNA的表达量明显低于对照组，提示莪术油不仅有抗单纯的游离型病毒感染的能力，对于整合于宿卞细胞染色体上的病毒基因片段亦可能有抑制作用，并可通过抑制相应基因的表达来抑制肿瘤细胞的增殖分裂。这也为含莪术的保妇康栓具有抗病毒及抗肿瘤作用提供了分了生物学依据。但该药对HPV16—E6 , E7基因片段的抑制并无明显量效关系，提示该途径可能并非莪术油发挥抗肿瘤作用的唯一途径。
综上所述，通过本实验，从细胞及分了生物学水平证实了以羲术油为卞要成分的保妇康栓确有抑制肿瘤细胞的作用，而其作用机制有待进一步深入探讨。
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