编译：微科盟橙子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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导读
线粒体参与多种代谢途径，其失调导致多种疾病，包括衰老相关疾病。然而，线粒体疾病的代谢变化和机制尚不完全清楚。在这里，我们发现来自线粒体肌病、脑病、乳酸酸中毒和卒中样发作（MELAS）患者的诱导多能干细胞（iPSCs）在糖酵解被抑制时显示增殖和存活减弱的现象，牛磺酸可以挽救这些减弱的现象。代谢组学分析显示，在MELAS-iPSCs中，还原型谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比值降低；而GSH底物半胱氨酸和氧化应激标记物的水平上调。牛磺酸使这些变化正常化，表明MELAS-iPSCs受到氧化应激的影响，牛磺酸降低了氧化应激的影响。我们还利用三维培养系统分析了从MELAS-iPSCs分化而来的视网膜色素上皮（RPE），发现其具备上皮-间充质转化（EMT），但可以被牛磺酸抑制。因此，线粒体功能障碍导致代谢改变，氧化应激的积累导致GSH的耗竭，而RPE中的EMT可能参与视网膜的发病机制。由于这些现象对牛磺酸治疗敏感，我们认为牛磺酸的应用可能是线粒体相关视网膜疾病的一种潜在的新治疗方法。
论文ID
原名：Taurine rescues mitochondria-related metabolic impairments in the patient-derived induced pluripotent stem cells and epithelial-mesenchymal transition in the retinal pigment epithelium译名：牛磺酸可以修复患者诱导多能干细胞中线粒体相关的代谢损伤和视网膜色素上皮中的上皮-间充质转化
期刊：Redox Biology
IF：11.799发表时间：2021.05通讯作者：Yoko Ozawa
通讯作者单位：日本庆应大学医学院
实验设计
实验结果
1. 来自MELAS患者的iPSCs的特征
来自MELAS患者（A24#13）的三个iPSC系在编码tRNALeu（UUR）的MTTL1 mtDNA中有A3243G突变（图1A），表达多能标记物，如OCT4、NANOG、TRA1-60和碱性磷酸酶（图1B）。我们使用针对WT或A3243G点突变mtDNA序列的特异性引物（图1A），我们通过实时PCR（图1C）确认每个iPSC系中WT和突变mtDNA的水平。我们在对照iPSCs（454E2）中几乎找不到突变mtDNA，但是在MELAS iPSCs（A24#1-3）中却有相当数量的突变mtDNA（图1C）。与对照iPSC细胞系相比，三种MELAS-iPSC细胞系分离后细胞数量的增加显著减弱（图1D）。然而，在电子显微镜图像中我们测得的线粒体大小在对照组和MELAS-iPSCs之间没有差异（图1E）。
图1 来源于MELAS患者的iPSCs特征
（A）mtDNA中tRNA基因MELAS突变位点的序列。编码tRNALeu（UUR）的突变MTTL1基因在mtDNA 3243位（A3243G）含有A到G的替换。正向WT和Mut引物，以及qPCR分析的反向引物。（B）MELAS（A24#1-3）iPSC细胞系多能性标记（OCT4，NANOG，TRA1-60，绿色；碱性磷酸酶活性，红色）染色。（C）对照组（454E2）和MELAS（A24#13）iPSCs中WT和Mut mtDNA的拷贝数用qPCR定量，并标准化为核DNA（FBXO15）水平（4个重复）。*P<0.05：对照组（454E2）和MELAS（A24#1-3）iPSCs之间WT mtDNA水平的比较；P<0.05：对照组（454E2）和MELAS（A24#1-3）iPSCs之间Mut mtDNA水平的比较。（D）对照组（454E2）和MELAS（A24#1-3）iPSCs在培养3天内的数量变化（n=3；*P<0.05）。（E）电镜图像中线粒体区域缺乏变化（n=30-42）。 2. MELAS iPSCs的呼吸缺陷
由于线粒体在OXPHOS中起着关键作用，OXPHOS利用氧气来促进ATP的产生，因此使用通量含量分析仪来测量每个iPSC生产线中的耗氧率（OCR）（图2A-C）。在基线检查时，所有三个MELAS iPSCs的OCR显著降低（A24#1-3）（图2B），表明MELAS iPSCs的线粒体呼吸受到抑制。应用1 μM寡霉素（一种抑制OXPHOS的ATP合酶抑制剂）可降低对照组和MELAS-iPSCs中的OCR，表明MELAS-iPSCs保留了OCR，这取决于ATP合酶活性。应用10 μM BAM15（一种诱导线粒体膜去极化并使OCR最大化的线粒体质子粒解偶联剂）证明，与对照iPSC相比，所有三种MELAS iPSC中的最大OCR也降低（图2C）。在同一个实验中，细胞外酸化率（ECAR）描述了糖酵解（图2D-F）产生的乳酸的形成，在基线水平（图2E）和寡霉素给药后（图2F）也降低了，这表明线粒体外的呼吸系统也受损，无法补偿所有MELAS-iPSC品系（A24#1-3）中的OXPHOS缺乏。在基线水平，MELAS-iPSC系中线粒体基因ND6（图2G）、丙酮酸脱氢酶E1亚单位α1（PDHA1，图2H）和乳酸脱氢酶（LDHB，图2I）的mRNA水平下调。编码呼吸系统相关蛋白的其他基因，如己糖激酶-2（HK2）、丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）、烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）、葡萄糖转运蛋白1和3（SLC2A1、SLC2A3）以及单羧酸转运蛋白4（SLC16A3）在MELAS iPSC系中也表达较低水平（图S1）。上述分子的作用如图2J所示。
3. 牛磺酸对MELAS iPSCs的细胞保护作用
为了确定对线粒体疾病有效的潜在细胞保护药物，我们建立了一个药物筛选系统（图2K）。用钙黄绿素染色，然后对图像进行二值化，并用ImageJ程序测量染色面积，以此来评估活细胞的数量。首先，为了激活MELAS-iPSCs中的线粒体，我们将PDK抑制剂如JX06、DCA和DAP添加到培养基中。我们发现这些药物对MELAS-iPSCs有相当大的毒性，而有些药物增加了对照iPSCs的数量（图S2）。然后，我们分析了牛磺酸的作用；在本实验中，我们添加了浓度为2.5 mM的2DG，这减少了活的MELAS iPSC的数量，但没有减少对照iPSC的数量（图2K）。该系统在2DG给药下使用钙黄绿素染色显示，通过2DG给药，活的MELAS iPSCs的减少显著减弱（图2K）。然后，我们分析了2DG诱导的MELAS-iPSCs活细胞数的减少和牛磺酸的拯救是否是由于细胞增殖和/或细胞死亡的改变。Ki67的免疫荧光染色显示，在所有三种MELAS-iPSC细胞系中，牛磺酸增加了增殖细胞的数量，2DG减弱了增殖细胞的数量（图2L）。抗切割的半胱天冬酶3抗体染色显示，给予牛磺酸后，2DG诱导的MELAS A24#2和A24#3 iPSC凋亡增加减弱（图2M）。对照组iPSCs（454E2）中，2DG单独或与牛磺酸合用均未改变细胞增殖和死亡程度。因此，牛磺酸选择性地抵消了MELAS-iPSCs中细胞增殖的减少和细胞死亡的增加。
图2 MELAS-iPSCs的代谢缺陷
（A-C）用细胞外流量分析仪测量对照组（454E2）和MELAS（A24#1-3）iPSCs的耗氧率（OCR）和（D-F）细胞外酸化率（ECAR）。将寡霉素（ATP合酶抑制剂，1 μM）、BAM15（线粒体质子体解偶联剂，10 μM）和R/A（鱼藤酮，线粒体电子传递链复合物I抑制剂，2 μM；抗霉素A，线粒体电子传递链复合物III抑制剂，2 μM）依次添加到孔中。对照组（454E2）和MELAS（A24#1-3）iPSCs的OCRs在基线（B，1 min 23 s）和添加BAM15（C，53 min 23 s）后的最大耗氧量条件下进行比较。对照组（454E2）和MELAS（A24#1-3）iPSCs的ECARs在基线（E，1 min 23 s）和添加寡霉素后的最大细胞外酸化条件（F，27 min 21 s）下进行比较。（A-F）n=34。（G-I）编码NADH脱氢酶6（ND6，G）、丙酮酸脱氢酶E1亚单位α1（PDHA1，H）和乳酸脱氢酶-B（LDHB，I）的mtDNA基因的mRNA水平（n=3）。（J） MELAS-iPSCs能量代谢途径变化示意图。（K-M）通过钙黄绿素（绿色，K）染色活细胞、通过抗Ki67（红色，箭头，L）染色增殖细胞和通过抗切割半胱氨酸蛋白酶3（绿色，箭头，L）染色死亡细胞的示例，M）在对照组（454E2）和MELAS（A24#2）iPSCs中，用DAPI（L和M中的蓝色）加或不加2.5 mM 2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）和1 mM牛磺酸（Tau）对细胞核进行复染。2DG通过减少增殖和增加死亡细胞的数量来减少MELAS-iPSC的数量，而牛磺酸抵消了这两个过程（n=3）。 4. 牛磺酸增加MELAS iPSCs中GSH/GSSG比值
为了了解牛磺酸的保护作用机制，我们对对照组（454E2）和MELAS（A24#2）在牛磺酸存在或不存在的情况下生长的iPSCs进行了代谢组学分析。我们发现，在MELAS iPSCs中，还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的显著减少，以及由此导致的GSH/GSSG比率的降低，都是由牛磺酸所拯救的（图3A）。MELAS iPSCs中半胱氨酸水平增加，编码谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚单位（GCLC）和谷胱甘肽合成酶（GSS）的基因的mRNA表达在MELAS iPSCs中上调（图S3），表明GSH合成增加。然而，在MELAS-iPSCs中GSSG增加（图3A）。总之，GSH被广泛地合成，但其利用率可能已经大大提高，并且超过了MELAS-iPSCs的产量，从而降低了GSH/GSSG的比率。这很可能是因为MELAS iPSCs经历了更高的氧化应激，编码抗氧化酶（图3B）、血红素氧化酶1（HMOX1，HO-1，图3C）、过氧化氢酶（CAT，图3D）和谷胱甘肽还原酶（GSR，图3E）的基因表达上调证明了这一点。然而，牛磺酸处理使GSH/GSSG比值升高，而半胱氨酸降低，表明牛磺酸降低了氧化应激水平和GSH消耗。同样，牛磺酸不仅降低了HMOX1（图3C）、CAT（图3D）和GSR（图3E）的mRNA水平，而且还降低了而且还降低了MELA或对照iPSC中，或者WT和突变系中，谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1，图3F）和超氧化物歧化酶2（SOD2，图3G）的mRNA水平。在牛磺酸处理的MELAS iPSCs（补充材料，图S3）中，具有还原能力的牛磺酸中间产物低牛磺酸的水平没有增加（图3A），编码产生低牛磺酸、CDO1、CSAD和ADO的酶的基因都下调，支持了牛磺酸治疗后不需要亚牛磺酸抗氧化作用的观点。在MELAS-iPSCs中，产生NADPH和增加GSH水平的戊糖磷酸途径（PPP）的活性被上调（图S4），表明PPP在氧化应激条件下被诱导增加GSH的产生。然而，PPP活性的增加并不充分，很可能是由于消耗GSH的氧化应激水平异常高。我们在MELAS iPSCs中观察到磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的累积，其被牛磺酸处理抑制（图S4）。尽管编码丙酮酸激酶M1和M2（PKM1和PKM2）的基因的mRNA水平增加，但氧化应激对PKM1和PKM2的失活可能抑制了PEP向丙酮酸的转化，而牛磺酸对氧化应激的降低允许转化（图S4）。三羧酸（TCA）循环代谢物的水平没有改变（图S4），尽管MELAS iPSC的OCR降低。PPP的激活可以通过氮转移途径诱导核苷酸的产生。编码磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶（PPAT）的基因表达增加，该酶是核苷酸生物合成途径中的关键酶（图S4），并且在MELAS iPSC中核酸水平保持甚至增加，MELAS iPSC中PPAT对牛磺酸敏感（图S5）。MELAS-iPSCs中的氨基酸也增加，牛磺酸处理降低了这种升高（图S5）。考虑到在MELAS-iPSC系（A24#2）（图S6）中，自噬相关分子LC3B的mRNA表达增加，而牛磺酸处理使其表达下调，因此MELAS-iPSC中的自噬可能受到影响。在没有或存在牛磺酸的情况下，编码氨基酸转运蛋白SLC7A5、SLC7A8、SLC43A1、SL43A2、SLC7A11和SLC3A2的基因在MELAS iPSC中的表达水平发生了变化，表明氨基酸水平的变化可能至少部分与MELAS iPSC摄取氨基酸的变化有关（图S6）。在MELAS iPSCs中，尿素循环中氨基酸的代谢物增加（图S7），表明氨基酸可以在OXPHOS失调的条件下用作能量源。相反，牛磺酸降低了氨基酸水平，这表明这种治疗可能使能量需求正常化。
图3 牛磺酸对MELAS-iPSCs中GSH/GSSG比值降低的修复作用
（A）通过代谢组分析测定甲基化产物的数量。在MELAS-iPSCs中，GSH/GSSG比值降低，但是通过1 mM牛磺酸的处理，它被恢复。对照组iPSCs（454E2）、MELAS-iPSCs（A24#2）和MELAS-iPSCs（A24#2）经牛磺酸处理后的数据分别用蓝色、红色和绿色条表示（n=6）。（B）在没有和存在牛磺酸的情况下，MELAS-iPSCs中氧化还原途径的示意图。（C-G）抗氧化酶血红素氧合酶1（HMOX，C）、过氧化氢酶（CAT，D）、谷胱甘肽还原酶（GSR，E）、谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1，F）和超氧化物歧化酶2（SOD2，G）的mRNA水平（n=3）。 5. MELAS iPSCs衍生的RPE的特征
因为据报道MELAS患者表现出RPE退化的现象，所以我们对从对照组（454E2）和MELAS（A24#1-3）iPSC（图4A）的视网膜类器官培养物中分化出来的RPE样本进行了分析。经过60天的培养，在类器官中发现的色素细胞簇被我们挑选出来，并被镀在涂有基质胶的培养皿上，然后我们进行了几次纯化（图4B）。尽管对照组和MELAS-iPSC衍生的RPE都有色素沉着，并且表达了RPE标记OTX2和紧密连接标记ZO-1（图4B），但是我们在MELAS-iPSC衍生的RPE中观察到的由ZO-1染色包围的规则六边形比在对照组iPSC衍生的RPE中观察到的要少（图4B和C）。此外，来源于MELAS-iPSCs的RPE细胞的大小大于对照组（图4D）。在此条件下，MELAS-iPSC衍生的RPE中的突变体mtDNA水平被证实保持不变（图4E）。
图4 MELAS-iPSC衍生的RPE结构不规则性
（A）视网膜类器官三维培养及视网膜色素上皮细胞分化培养程序。（B）从对照组（454E2）和MELAS（A24#2）iPSCs获得的色素细胞经多次传代纯化后产生RPE。RPE细胞呈六角形，表达紧密连接（ZO-1，绿色）和RPE（OTX2，红色）标记。（C）对照组（454E2）和MELAS（A24#2）iPSCs的RPE细胞形状通过计算其圆度来定量。MELAS-iPSC衍生RPE形态不规则（n=6，每组分析平均1000个以上细胞）。*P<0.05。（D）对照组（454E2）和MELAS（A24#2）iPSCs的RPE细胞体的大小通过ZO-1包围的区域进行量化。n=1000，*P<0.05。（E）qPCR（4个重复）测定对照（454E2）和MELAS（A24#1-3）iPSCs的RPE中WT和Mut mtDNAs的拷贝数。 6. MELAS iPSCs衍生RPE的呼吸缺陷和EMT
MELAS-iPSC衍生RPE（图5A-C）的OCR在基线水平（图5B）和存在线粒体原核载体解偶联剂BAM15（图5C）时均降低。在MELAS-iPSC衍生的RPE（图5D F）中，ECAR在基线水平（图5E）和寡霉素抑制OXPHOS后（图5F）都降低，表明在MELAS-iPSC中，OXPHOS损伤并没有通过分化RPE中的糖酵解得到补偿。MELAS-iPSC衍生RPE中编码mtDNA基因ND6的mRNA表达水平下调（图5G），而过氧化氢酶mRNA显著上调（图5H），这共同表明MELAS-iPSC衍生RPE中的氧化应激水平较高。视网膜色素上皮是单层上皮，有助于光感受器和脉络膜之间的屏障。然而，当EMT发生时，诸如年龄相关性黄斑变性等视网膜疾病会被促进。我们发现，与对照组（454E2）iPSC衍生RPE相比，MELAS iPSC衍生RPE中EMT标记物锌指E-box1（ZEB1，图5I）、snail家族锌指1（SNAI1，图5J）、twist相关蛋白1（TWIST1，图5K）和肌动蛋白α2（ACTA2，图5L）的mRNA水平增加。此外，钙粘蛋白2（CDH2，图5M）的mRNA水平升高，钙粘蛋白3（CDH3，图5N）降低，这与之前的报告一致，该报告显示在动物模型中RPE的EMT期间钙粘蛋白表达水平发生变化。细胞体的增大（图4D）与EMT的倾向一致，并导致MELAS iPSC衍生的RPE细胞从上皮组织迁移出去，因为RPE细胞体在邻近细胞丢失时增大。
图5 MELAS-iPSC衍生RPE的呼吸功能缺损
（A-C）对照组（454E2）和MELAS（A24#1-3）iPSC衍生RPE样品的耗氧率（OCR）和（D-F）细胞外酸化率（ECAR）。依次将寡霉素（1 μM）、BAM15（10 μM）和R/A（鱼藤酮，2 μM；抗霉素A，2 μM）添加到孔中。对照组（454E2）和MELAS组（A24#1-3）在基线（B，1 min 23 s）和添加BAM15（C，53 min 20 s）后的最大耗氧量条件下比较iPSC衍生RPE的OCR。对照组（454E2）和MELAS（A24#1-3）的ECARs与iPSC衍生的RPE在基线（E，1 min 23 s）和添加寡霉素后的最大细胞外酸化条件下（F，27 min 21 s）进行比较，n=34。（G-N）对照组（454E2）和MELAS（A24#1-3）iPSC衍生RPE中编码NADH脱氢酶6（ND6，G）、抗氧化酶过氧化氢酶（CAT，H）以及编码上皮间质转化标记物ZEB1（I）、SNAI1（J）、TWIST1（K）、ACTA（L）、CDH2（M）和CDH3（N）的mtDNA基因的mRNA水平。 7. 牛磺酸对MELAS iPSCs衍生RPE的EMT的抑制作用
我们研究了牛磺酸对iPSC衍生RPE中EMT相关变化的影响。MELAS-iPSC衍生RPE中ZEB1（图6A）、SNAI1（Snail，图6B）、TWIST1（图6C）和ACTA2（αSMA，图6D）表达水平的增加均通过牛磺酸处理逆转（图6A-D）。EMT通常由TGFβ诱导，并且MELAS-iPSC衍生RPE中TGFB1（图6E）和TGFB2（图6F）mRNA水平的上调也被牛磺酸给药抑制。除了这些与EMT相关的变化外，MELAS iPSC衍生RPE中ACTA2（αSMA）阳性细胞的数量也受到牛磺酸的抑制（图6G和H）。此外，我们观察到MELAS iPSC衍生的RPE的细胞核表现出抗氧化转录因子NRF2的更高积累，该转录因子在氧化应激下易位到细胞核中，并且这种效应通过牛磺酸处理而减弱（图6I和J），暗示牛磺酸可降低MELAS-iPSC衍生RPE的氧化应激。
图6 牛磺酸对MELAS-iPSC-RPE上皮-间充质转化过程的保护作用
（A）对照组（454E2）和MELAS组（A24#2）中编码上皮间充质转化标记物ZEB1（A）、SNAI1（B）、TWIST1（C）、ACTA（D）、TGFB1（E）和TGFB2（F）的基因的mRNA水平在没有或存在牛磺酸治疗的情况下同样产生RPE（n=3）。（G-J）在没有或存在牛磺酸处理的情况下，对MELAS（A24#2）iPSC衍生RPE中的ACTA（αSMA）（G，绿色；H）和NRF2（I，绿色，用品红DAPI复染；J）细胞进行染色（n=6）。
讨论
我们证明MELAS患者来源的iPSCs具有线粒体呼吸功能缺陷，不能通过糖酵解得到补偿。我们通过给予牛磺酸使MELAS-iPSCs中GSH/GSSG比值降低和氧化应激标记物增加正常化，从而挽救了MELAS-iPSCs增殖和存活率降低。在MELAS-iPSCs衍生的RPE中，六角形结构以及呼吸功能受到干扰。EMT标记物在来源于MELAS-iPSCs的RPE中增加，并且所有这些变化都被牛磺酸给药逆转。此外，牛磺酸也抑制了MELAS-iPSCs核NRF2的积累。
1. MELAS iPSCs能量代谢
在目前的研究中，MELAS-iPSCs的基础OCR和最大OCR降低，这与以前的报道结果一致，这可能与分离后iPSC生长受损有关。我们通过2DG抑制糖酵解来研究线粒体呼吸，发现MELAS iPSCs的细胞增殖和存活都受到损害，而相同剂量的2DG对对照组iPSCs没有影响。由于MELAS-iPSCs的糖酵解和线粒体呼吸系统均受损，糖酵解能力最低限度的降低可能是生存的关键。重要的是，牛磺酸治疗挽救了细胞，而PDK抑制剂激活PDH以增加TCA循环底物的水平却没有。相反，在MELAS-iPSCs中，TCA循环底物的过载可能是细胞毒性的，支持了MELAS发病机制可能涉及对异常工作的线粒体呼吸系统的过度应激的观点。由于该系统在MELAS-iPSCs中保持功能，尽管OCR数据显示其水平较低，不适当的反应可能会增加氧化应激。
2. MELAS iPSCs的氧化应激及其牛磺酸的减少作用
值得注意的是，MELAS-iPSCs的GSH水平较低，GSSG水平较高，导致GSH/GSSG比值较低。GSH的底物半胱氨酸水平升高，氧化应激标记物升高，表明在MELAS-iPSCs中GSH被产生但被消耗以适应氧化应激。MELAS-iPSCs中ECAR、乳酸、丙酮酸的减少和上游代谢物PEP的增加很可能是由于氧化应激使将PEP转化为丙酮酸的PKM失活。这种失活可能是一种代偿性改变，以减少TCA循环反应和OXPHOS试图减少氧化应激。PPP的上调可能增加了GSH的水平，但不足以预防MELAS相关的氧化应激。上调的PPP可能与谷氨酰胺代谢结合，以增加产生核苷酸的氮转移。一般来说，核苷酸的增加可以诱导细胞增殖，这在癌细胞中可以观察到，然而，在MELAS-iPSCs中，增殖没有增加，而是受损。因此，核苷酸的增加可能是增殖增强的必要条件，但不充分，线粒体失调引起的氧化应激增加对增殖有负面影响。据报道，氧化应激的增加和GSH的减少导致细胞周期停滞，干扰细胞增殖。因此，氧化应激增强以及GSH系统失调可能导致MELAS-iPSCs增殖受损，尽管它们的核苷酸生物合成增加。总的来说，正常的线粒体状态是调节氧化应激所必需的，即使线粒体OXPHOS机制在PSC中与糖酵解不耦合。在我们的实验中，牛磺酸的细胞保护作用之一是在缺乏半胱氨酸或GSH合成酶表达增强的情况下，GSH/GSSG比值增加。考虑到氧化应激标记物降低，牛磺酸可能通过不同于产生GSH的途径降低氧化应激水平。牛磺酸参与多种生物过程，在特定组织中含量很高，包括视网膜、大脑和肌肉。牛磺酸可清除许多活性氧和氮物种，饮用含牛磺酸的水可增强抗氧化能力。据报道，牛磺酸在一些细胞系中可激活NRF2并诱导其下游抗氧化反应元件应答基因，包括HMOX1（HO-1），但本研究中未观察到这一点。此外，牛磺酸被线粒体吸收，在线粒体中，它通过形成线粒体tRNA的5-牛磺酸甲基尿苷和5-牛磺酸甲基-2-硫尿苷来修饰尿苷，从而增强密码子的有效结合，然而，牛磺酸的这种作用机制还需要进一步的详细研究。
3. 线粒体疾病中EMT的倾向
牛磺酸对来源于MELAS-iPSCs的RPE也有保护作用，表明其有发生EMT的倾向。正如通过手术提取的附于脉络膜新生血管的人类RPE样本所示，RPE的EMT参与AMD的发病机制。TGFβ是一种在RPE中诱导EMT的炎性细胞因子，在MELAS iPSC衍生的RPE中上调，这与之前的报告一致，该报告显示MELAS cybrids中的miRNAs失调导致TGFB表达增强。据报道，线粒体功能障碍可改变RPE细胞系的细胞内Ca2 信号和核基因表达。线粒体被认为是几种癌症相关现象的关键角色，包括侵袭性和转移，这些现象是由EMT引起的。氧化应激和EMT之间的相互作用是众所周知的。此外，氧化应激和炎症相互作用，相互促进，在MELAS iPSC衍生的RPE中，TGFB被诱导；或者，EMT诱导可能是通过线粒体丙酮酸载体敲低所引起的谷氨酰胺代谢变化来实现的。线粒体紊乱可能参与EMT的诱导过程。牛磺酸降低了MELAS-iPSCs的氧化应激和谷氨酰胺代谢的正常化，暗示它可能通过多种途径抑制EMT。
4. MELAS iPSCs作为一种药物筛选系统
我们构建了一个药物筛选系统，利用2DG给药抑制糖酵解，还利用MELAS-iPSCs中的线粒体功能障碍，通过测量图像中活细胞的面积，很容易评估其效果。该系统可用于鉴别除牛磺酸外对线粒体疾病有效的药物。先前的报告描述了几种可能在其他体外系统中有效治疗MELA和线粒体功能障碍的潜在药物，例如I-BET 525762A，pan-BET抑制剂，核黄素和辅酶Q10，以及β-拉帕酮，NAD（P）H醌氧化还原酶1的底物。在未来的研究中，我们将对这些候选药物进行测试。
5. 与基因疗法相比，使用牛磺酸的优点
利用线粒体靶向ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9进行突变线粒体DNA消除，通过胞苷脱氨酶编辑特定碱基可以改变细胞功能，包括OCR。这些基因编辑技术可应用于人类iPSC衍生疾病模型。然而，与全身给药的效果相比，这些程序对于影响多个组织和器官和/或单个组织大面积的疾病未必有用。总之，我们已经建立了MELAS患者来源的iPSC细胞系，并分析了这些细胞以及从中分化的RPE的表型。牛磺酸能促进MELAS-iPSCs的增殖和存活，部分挽救MELAS-iPSCs衍生RPE的病理性EMT状态。目前的研究将有助于将来牛磺酸在MELAS和其他伴有线粒体紊乱的疾病中的临床试验。原文链接： https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33706170/
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