T细胞特异性杀伤肿瘤的特性为将来的肿瘤治疗带来无限可能，现今CAR-T细胞免疫疗法正处在快速发展阶段，不管是在临床前试验还是最近获批用于白血病和淋巴瘤的生物药品，CAR-T细胞疗法都是很有前景的肿瘤免疫治疗技术。近日，最新一期《Science》刊登了CAR-T细胞治疗领域的大咖Carl June的一篇综述，全面讲述了CAR-T细胞疗法的研究历程及未来面临的机遇和挑战，快来跟小编一起饱尝这顿CAR-T细胞领域的大餐吧。 1 CAR-T细胞疗法研发历程 1.1 先来聊聊TCR-T疗法抗肿瘤治疗之路 临床上第一个TCR-T细胞免疫疗法应用在了转移性黑色素瘤患者中，这项试验中应用的TCR是将HLA-A2限制性多肽与黑色素细胞分化抗原MART-1相结合。后为了提高对MART-1低表达恶性细胞的识别，在此基础上又研制出了一种对MART-1抗原具有高亲和力的TCR。虽然有效率得到提高，但脱靶效应也相继而来：这种具有高亲和力的TCR靶向了皮肤、眼睛和耳蜗中正常的黑色素细胞。试验当中过半数的患者都出现了这种脱靶毒性，这也带来一个新启示：当针对肿瘤相关性抗原时，其有效率跟毒性之间真的是分不开的。 TCR疗法在开发过程中也遭受了重创。2011年，在NCI进行的靶向癌睾丸抗原MAGE-A3的TCRs治疗实体瘤的临床试验中，开始接受治疗的9例患者中有3例患者在接受治疗后立即出现严重的精神症状，其中的两例迅速陷入昏迷，并不幸去世。后续的研究表明这种MAGE-A3 TCR意外地能够与在大脑中的相关多肽MAGE-A12相结合。 直接靶向MAGE-A3 的这两种TCR疗法中出现的严重神经和心脏毒性无疑是加重了TCR免疫疗法的挑战。然而,转机来了，研究显示与HLA-A2限制性多肽亲和力更强的靶向癌睾丸抗原NY-ESO-1 TCR-T细胞显示出临床疗效，重要的是并没有出现明显的毒性。这些试验结果重新燃起了研究者的希望。目前NYESO-1 TCR-T细胞正在进行后期的临床试验评估。 1.2 CAR-T突破了TCR-T抗原识别的限制 TCR-T疗法和CAR-T疗法的制备工艺都是对患者自身的T淋巴细胞进行体外改造，然后再输注回患者体内杀伤肿瘤，但是这两种疗法识别抗原的机制却截然不同。TCR是利用α和β肽链构成的异二聚体来识别由MHC呈现在细胞表面的多肽片段。而CAR则是利用能够与特定抗原结合的抗体片段来识别肿瘤细胞表面的抗原。 从细胞表面蛋白和细胞内蛋白中获得的肽链MHC分子都可以呈递，因此TCR可以靶向更多种类的抗原，而CAR-T细胞只能靶向肿瘤细胞表面抗原。但CAR也突破了TCR-T细胞疗法上的一些限制，比如TCR-T需要MHC表达，MHC一致性和协同共刺激信号。肿瘤免疫耐受的一种重要机制就是肿瘤细胞上MHC相关的抗原呈递因子表达缺失，因此CAR-T细胞也就明显具有了重要的抗肿瘤优势。
图1 CAR与TCR结构设计
1.3 CAR-T疗法研发历程
第一代CAR-T研发出来以后很快就被投入临床，虽能看到一些特异性的细胞毒性，但在2006年进行临床试验总结时却发现疗效差强人意。究其原因，第一代CAR-T细胞在病人体内很快就会耗竭，持久性很差，以至于CAR-T细胞还没有来得及接触到大量的肿瘤细胞时就已经凋亡。
在2011年，靶向CD19和编码共刺激区域的第二代CAR-T技术成为T细胞治疗的主流。CD19是正常和恶性B淋巴细胞特异性表达的表面蛋白，在B细胞发育、增殖和分化以及恶性转化中发挥重要作用。CD19在B淋巴细胞表达的特异性和在恶性肿瘤表达的广泛性，使其在治疗B淋巴细胞恶性肿瘤时颇具潜力。大部分的复发性白血病患者在接受了CD19 CAR-T治疗后达到完全缓解。但免疫耐受也同样出现了，在急性白血病患者中， CD19抗原表位缺失似乎是肿瘤免疫耐受的主要机制。这跟在TCR-T疗法中观察到的获得性抗原呈递缺陷或抗原缺失导致的抗原逃逸机制很像。成人和儿童急性白血病患者的国际性试验数据显示，CD19阴性缺失所导致的复发概率竟达到28%。目前还没有报道说CD19缺失是慢性淋巴细胞白血病耐受的原因；推测慢性淋巴细胞白血病出现耐受可能是因为CAR-T细胞输注后在体内的扩增受限。
CAR-T技术目前得到广泛应用。除了CD19，靶向BCMA和CD22的CAR-T细胞治疗也相继被投入临床。早期临床试验结果显示，靶向后两种靶点在多发性骨髓瘤和急性淋巴细胞白血病中也出现了与CD19相似的抗瘤活性，跟CD19一样，这两种抗原同样在B细胞谱系中具有高度特异性。
从CAR-T细胞疗法评估其他靶点的早期临床试验结果来看，CD19的脱靶交叉反应虽并非个例，但在其他靶点中更常见。靶向BCMA或CD269的晚期骨髓瘤临床试验结果显示，除了恶性骨髓瘤细胞，表达BCMA的非恶性浆细胞也被清除了，而靶向哪种正常的组织或细胞决定了对这种脱靶毒性的耐受性。
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CAR-T疗法在实体瘤中面临的挑战
2.1 脱靶毒性
ERBB2/HER2蛋白是一种酪氨酸受体激酶，在肿瘤细胞中广泛过表达，是抗体或抗体结合剂的有效靶点。但靶向ERBB2/HER2的CAR-T疗法在第一例患者中就出现了致命的毒性。后来的第三代CAR技术的应用研究显示，这种毒性是由于低表达ERBB2的肺上皮细胞被错误识别并杀伤，导致了肺损伤和大量细胞因子释放。
而靶向CAIX的第一代CAR-T细胞在肾细胞癌的I期临床试验中也遭遇了意外的肝脏毒性，这种肝毒性是由于CAIX抗原在正常胆管上皮细胞中低表达，而这种毒性在临床前试验阶段并未被发现。
靶向CEACAM5的CAR-T细胞治疗所带来的延迟呼吸毒性与T细胞扩增也表明了靶向这种抗原或许可以带来抗瘤疗效和脱靶毒性。
靶向其他肿瘤相关性抗原的CARs临床试验，包括间皮素、癌胚抗原、GD2神经节苷脂，并没有显示出明显的毒性，但抗瘤活性也很小。在临床前阶段GD2 CAR-T细胞抗瘤活性增强，但也引起了非常严重的神经毒性，这加剧了接下来的挑战。
而在多形性胶质细胞瘤中局部注射靶向IL13Rα2的CAR-T细胞证实其具有抗瘤活性，而且没有发现明显的毒性。这提示直接靶向抗原进行瘤内注射或可增加治疗指数。
靶向EGFRvIII的CAR-T细胞疗法相对安全，但一些患者也出现了瘤内EGFRvIII抗原缺失，这也进一步说明靶向多种抗原有利于防止抗原逃逸。
肿瘤微环境也是过继性细胞免疫治疗成功应用要面临的另一道很高的门槛，尤其在实体瘤中。目前研究比较清楚的抑制T细胞免疫活性的因子包括免疫检查点、肿瘤代谢微环境的改变、调节T细胞和MSC细胞。过继细胞输注后瘤内这些免疫和代谢抑制因子的上调，意味着即将出现获得性耐受。CD19 CAR-T细胞联合PD-1/PD-L1抑制剂的临床试验目前正在进行中。此外，联合其他免疫检查点抑制剂的临床试验也在开展中。
2.2 CAR-T细胞治疗的毒性反应及机制
CAR-T细胞治疗的常见毒性为严重的细胞因子释放综合征。这种综合征甚至比TIL和TCR-T细胞治疗中常见的流感样综合征更厉害。研究显示，CRS的严重分级与肿瘤负荷相关。最严重的CRS会出现包括嗜血细胞性淋巴细胞病和巨噬细胞激活综合征等。
除了CRS，CD19和BCMA CAR-T细胞的临床试验中还报道了不同程度的神经并发症。CD19 CAR-T细胞引起的神经毒性大部分是可逆的。但脑水肿是CRS的一种极端形式还是另有机制还不清楚。有证据表明内皮损伤可能与导致神经毒性的炎症细胞因子有关，这大大支持了另有机制这一说法。
图2 CAR-T细胞治疗的毒性反应
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提高CAR-T疗效和安全性的先进技术
3.1 提高亲和力或能增加CAR-T抗瘤活性
受体和配体的亲和力是影响大多数受体通路的重要生化因素。亲和力的工程化或许可以应用于CAR的设计来增加CAR-T细胞的抗瘤活性，调节靶向疗效和脱靶毒性。ERBB2/HER2编码的细胞表面受体与很多上皮细胞恶性肿瘤的病理相关。CAR与ERBB2/HER2亲和力的多样性增加了对抗原表达的辨别，就是说可以提高对正常上皮细胞上发现的低表达抗原和肿瘤细胞上高表达抗原的辨别能力。但显然，最佳亲和力的辨别并非那么简单，就像GD2 CAR临床前试验结果:肿瘤活性的提高也伴随严重神经毒性。除了亲和力，目前研究大力投入的还有CAR的胞外结构及跨膜结构和信号。遗憾的是，几乎没有明确的评价标准，而且CAR设计也存在很强的经验主义。此外，临床前试验结果不清晰也增加了CAR设计的复杂度。
3.2 通用型CAR-T或成未来趋势
基于MHC的限制，传统的CAR-T疗法中T细胞主要来源于患者自身。如果MHC的阻碍可以被克服，那么，相比患者自身的T细胞，异体供体或通用型T细胞治疗就具有了长足的优势。而且来自健康人的通用型CAR-T还有可能克服很多癌症治疗相关的免疫缺陷。再者通用型CAR-T疗法可以以工业级的标准进行提前制备，并且不受患者自身T细胞质量的影响。
Torikai教授的工作组是第一个采用基因编辑技术制备通用型CAR-T细胞的，这种通用CAR-T细胞中不含功能性内源TCR。基于TALEN基因编辑技术制备的通用型CAR-T，应用到两例患者的试验证实了通用型CD19 CAR-T疗法的可行性。但是，在这项试验中，通用型CAR-T细胞在体内扩增受限，因此这两例患者并未取得疗效。重要的是，在MHC I类等位基因错配的一位患者中出现了移植物抗宿主病，这可能与未被编辑的受污染的T细胞仍然存在内源性TCR有关，这也提示我们，通用型CAR-T疗法要想获得成功需要更完善的基因编辑技术。尽管阿伦单抗（免疫调节药物）可以调节免疫抑制，但NK细胞对MHC I类分子缺失细胞的识别仍然带来一定的局限性。抑制NK细胞对通用型CAR-T细胞溶解的方式是插入HLA-E，敲除HLA-A，-B和-C，来阻止自身T细胞攻击通用CAR-T细胞。鉴于该领域的快速发展，通用CAR-T细胞很可能会被广泛使用。关键的问题就在于通用型CAR-T细胞能不能像干细胞移植或自体CAR-T细胞治疗那样作为单一疗法或辅助疗法进行应用。
3.3 基因编辑技术带来的变革
目前有很多技术可以实现在DNA中引入靶向双链断裂的有效插入或删除，从而使靶基因失活。同源性修复可以用于在靶点插入感兴趣的基因。目前有很多基因编辑工具，而且这些技术也已经成功应用于工程T细胞。这个领域主要的难题在于细菌衍生的Cas9能否产生有效的免疫原性来干扰CRISPR-Cas9编辑的T细胞的传递。基因编辑技术带来了一种新的机遇，敲除CTLA-4或PD-1免疫抑制信号，可以增强T细胞功能，甚至可能都没有免疫检查点抑制剂的毒性。基因编辑技术还可用于敲除T细胞中CAR靶向的基因，这种基因虽可使CAR-T细胞靶向肿瘤相关抗原，但却使T细胞免疫疗法失效。最近，Eyquem教授研究组将CAR引入TCR中，这样受体表达可以被内源性TCR启动子所控制，从而显著提高CAR-T细胞的功能。
单一抗原区别肿瘤细胞和正常组织的能力有限，应用也受到限制。为了提高靶向肿瘤的特异性，联合传感方式可靶向两个或更多抗原。研究显示，合成的Notch信号通路可以通过转录方式结合双重抗原（《Science》长文：治疗实体瘤更有效的CAR-T疗法 | 白泽专栏）。结合抗原传感系统来理解CAR表达的动力学特征很重要，因为生理参数的转变可发生在CAR-T细胞输注后的几个小时内，当细胞内仍保持CAR表达，可能仍然可以调节毒性。
图3 Notch受体实现靶向双重抗原
为了减轻细胞回输带来的自身免疫反应风险， 研发了“自杀开关“，它可以诱导工程T细胞自发走向死亡。比如，引入FKBP2双聚小分子（iCasp9的双聚体分子），T细胞就会快速走向凋亡。在造血干细胞移植后同种异体淋巴细胞输注中，iCasp9方法已经得到了评估，并证明了可有效清除T细胞，可减轻自身免疫疾病。
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CAR-T疗法的成本效益
目前全球正在进行的CAR-T临床试验超过了250项。这些临床试验的数量存在地区差异，中国和美国CAR-T临床试验最多，成为转化研究的热门地区，而欧洲、日本和南半球相对来说要少很多。当然，出现这种地区差异的原因很复杂，包括对这种新疗法的接受和投资力度，卫生部门的监管政策以及社会文化的差异等。
图4 CAR-T细胞疗法开展临床试验的地区差异
血液瘤患者所接受的有效但非治愈性疗法带来的经济负担也是很大的挑战，特别是对CLL和多发性骨髓瘤患者。作为美国最常见的白血病形式，2000年约有100000名CLL患者，治疗只能改善生存状况，并不能达到治愈，因此给患者和社会带来巨大的经济负担。据估计，每例患者终生的治疗费用为604000美元，而到2025年，仅美国的CLL疾病管理总费用估计每年就要超过50亿美元。
跟传统疗法相比，CAR-T细胞治疗可能更具成本效益。但高度个性化的细胞免疫治疗，制备工艺也需要个性化，这大大增加了成本。相信随着制备工艺越来越成熟，CAR-T细胞治疗的成本肯定能降低到普通百姓能用得起的价格。
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总结
总的来说， CAR-T细胞疗法对于血液瘤绝对是一个突破。更重要的是，CAR-T是FDA批准的第一种转基因疗法。目前，细胞免疫治疗面临的最大挑战是缺乏临床前模型来评估药物的安全性和有效性。另外就是，在实体瘤方面的疗效还需要更大的突破。
但值得期待的是，随着工程T细胞、基因编辑和细胞制备工艺的发展，T细胞治疗很可能可以扩展到其他类型的细胞，比如多功能干细胞、造血干细胞和NK细胞，而且适用的疾病也不再单单是肿瘤，还可能是传染病、器官移植或自身免疫性疾病。
参考资料：
1. Carl H. June, et al. Science 359, 1361–1365 (2018)
2. Fesnak AD, et al. Nat Rev Cancer. 2016 Aug 23;16(9):566-81.
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