电针对阿尔茨海默病海马内源性神经干细胞增殖的影响

电针对阿尔茨海默病模型幼鼠

海马内源性神经干细胞增殖的影响

张松江，高剑峰，孙宁宁，李龙洋，李炎辉

（河南中医药大学医学院）

阿尔茨海默病（AD）的主要临床表现是认知和学习记忆功能障碍。其主要的病理改变是皮层和海马神经元外的β淀粉样蛋白（Aβ）沉淀（Aβ老年斑）和神经元内高度磷酸化的Tau蛋白形成的纤维缠结。冯晴等研究显示电针疗法对改善AD患者简易精神状态检查量表（MMSE）评分可能有一定持续效应，且电针在改善瞬时记忆力方面可能存在优势。夏昆鹏等研究证明电针百会、风府穴联合盐酸多奈哌齐可改善AD患者学习记忆能力。电针可有效改善AD模型动物的学习记忆功能，其机制可能与抑制神经元凋亡、改善突触可塑性和抗炎有关。诸多研究结果说明电针可以通过多途径刺激内源性神经干细胞的增殖分化，但是电针对AD模型幼鼠内源性神经干细胞的增殖分化的影响研究文献很少。本研究运用电针刺激AD模型幼鼠“百会”“风府”“肾俞”，探索其对海马内源性神经干细胞增殖的影响及其作用机制。

干预方法

适应性饲养1周后，电针组小鼠行电针干预。

取穴：“百会”（顶骨正中）、“风府”（枕骨顶嵴后枕寰关节背凹陷处）和“肾俞”（第2腰椎后两旁凹陷处），定位参照《实验针灸学》。

操作：固定小鼠，采用一次性无菌针灸针，“百会”向后、余穴向下斜刺入皮下约1mm，连接电子针疗仪，“百会”和左侧“肾俞”、“风府”和右侧“肾俞”分别连接一对电极，断续波，频率为10Hz，电流强度约为2mA，以刺激局部肌肉发生轻微抖动为佳。每次20min，每天1次，每周电针干预6d后休息1d，共干预16周。模型组和正常对照组只模拟电针时的抓取和固定，不进行电针刺激。

观察指标

（1）HE染色法观察小鼠海马齿状回神经元形态结构

（2）免疫组化法检测小鼠海马CA1区BrdU阳性表达

（3）免疫荧光法检测小鼠海马BrdU/NeuN阳性表达

（4）实时荧光定量PCR法检测小鼠海马BDNF和Nestin mRNA表达

（5）Western blot法检测小鼠海马BDNF和Nestin蛋白表达

结果

与正常对照组比较，模型组小鼠海马齿状回神经元结构不清晰，出现核固缩现象；海马CA1区BrdU阳性表达减少（P＜0.01）；海马BDNF和Nestin mRNA和蛋白水平均下降（P＜0.01，P＜0.05）。与模型组比较，电针组小鼠海马齿状回神经元轮廓较清晰，核结构较明显；海马CA1区BrdU阳性表达、BrdU/NeuN阳性表达均高于模型组（P＜0.01，P＜0.05）；海马BDNF和Nestin mRNA和蛋白水平均高于模型组（P＜0.05）。

讨论

内源性神经干细胞是一类起源于神经外胚层，能不断自我更新，并在一定条件下分化为神经元和胶质细胞的多潜能干细胞。有研究显示，阿尔茨海默病（AD）小鼠内源性神经干细胞增殖能力较正常鼠下降。5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，而胸腺嘧啶是DNA合成的原料之一。在神经干细胞增殖时期（S期），需要新生细胞DNA的合成。BrdU可以代替胸腺嘧啶渗入正在复制的DNA分子。通过免疫组化技术检测BrdU阳性表达，从而测定新生神经干细胞。BrdU的特性不仅能渗入到增殖或分裂细胞的核内，还能长期停留在分化细胞和子代细胞中。利用BrdU的这一特性，结合相应的神经元分化标记物进行免疫荧光双标技术检测，即可追踪内源性神经干细胞增殖后的迁移、存活和分化等。NeuN作为一种神经细胞特异性的蛋白分子，不仅是稳定而可靠的成熟神经元标志，且在确定神经元表型中具有重要作用，还可能参与调节神经元发育成熟的转录过程。因此BrdU/NeuN阳性表达可以标记向神经元分化的内源性神经干细胞。

关于电针对中枢系统疾病和损伤的内源性神经干细胞增殖分化影响的文献很多，也有研究显示电刺激可以促进神经元的生长。此外，适当的电刺激不仅能促进神经元的突触生长和神经干细胞的分化，而且能促进胶质细胞的生长。电针对AD模型小鼠神经干细胞增殖影响的研究报道不多。本研究采用免疫组化和BrdU/NeuN免疫荧光双标技术研究发现电针“百会”“风府”“肾俞”可以促进AD模型小鼠海马内源性神经干细胞的增殖和向神经元的分化，与既往研究结果一致。

Nestin是神经干细胞的特异性标记物，已有研究显示电针可以促进Nestin表达。本研究结果显示电针组Nestin mRNA和蛋白水平均高于模型组。此结果再次印证了电针对内源性神经干细胞增殖及向神经元分化的积极影响。另外，电刺激Schaffer侧支CA1突触可以促进海马CA1区BDNF表达。本研究结果也显示，电针刺激AD模型幼鼠后，BDNF mRNA和蛋白水平均提高，说明BDNF对于内源性神经干细胞增殖是有积极影响的，这和BDNF能促进内源性神经干细胞增殖的文献报道是一致的。